菌落直接PCR試劑盒(E.coli Colony Direct PCR Kit)是一種使用特別便捷的含有藍(lán)色和橙色染料(電泳位置分別約4kb和50bp)的2倍濃度的PCR預(yù)混液，含有2X Taq DNA Polymerase、2X PCR Buffer、2X dNTP和2X Loading Buffer等，只需加入大腸桿菌菌落或菌落稀釋物、引物和水即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增，并且擴(kuò)增完畢后可以直接上樣電泳。本試劑盒主要適用于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌后陽性克隆的菌落PCR篩選和鑒定。

本試劑盒對(duì)于大腸桿菌菌落的兼容性好。本試劑盒經(jīng)過反復(fù)優(yōu)化，確保直接挑取菌落進(jìn)行PCR的擴(kuò)增效果良好，菌落的存在不會(huì)顯著干擾PCR反應(yīng)。

本試劑盒使用特別便捷。菌落直接PCR試劑盒中提供的E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)已經(jīng)含有所有的通用組分，用戶只需自備引物和水即可對(duì)大腸桿菌菌落進(jìn)行PCR擴(kuò)增。它大大簡(jiǎn)化了PCR操作，使操作更加快捷，也減少了PCR操作過程中可能導(dǎo)致的污染，使PCR的重復(fù)性更好；同時(shí)E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)中已經(jīng)包含了上樣緩沖液組分，PCR擴(kuò)增結(jié)束后即可直接上樣電泳，無需添加上樣緩沖液。

本試劑盒擴(kuò)增效果好。本試劑盒可以擴(kuò)增出長(zhǎng)達(dá)8kb的片段，但通常更適合用于擴(kuò)增2kb以下的DNA片段。

本試劑盒中提供了雙色染料，便于電泳時(shí)觀察電泳進(jìn)程。本產(chǎn)品中加入了藍(lán)色和橙色的電泳示蹤染料(整體呈現(xiàn)綠色)，其在濃度為1%瓊脂糖膠中的遷移位置分別大約位于4kb和50bp處。PCR結(jié)束后可直接進(jìn)行電泳檢測(cè)，無需再添加上樣緩沖液。藍(lán)色和橙色示蹤染料不會(huì)影響對(duì)相應(yīng)DNA條帶的觀察和檢測(cè)。

本產(chǎn)品穩(wěn)定性高。經(jīng)測(cè)試，本試劑盒反復(fù)凍融15次后對(duì)PCR的擴(kuò)增效果無顯著影響。反復(fù)凍融15次前后，使用不同引物擴(kuò)增100-1500bp間不同長(zhǎng)度目的片段的效果如圖1所示。

圖1. 本產(chǎn)品用于大腸桿菌菌落PCR的效果圖。特定質(zhì)粒轉(zhuǎn)化DH5α菌株后涂板，第二天挑取10個(gè)克隆，采用質(zhì)粒上的通用引物并使用本試劑盒進(jìn)行菌落PCR檢測(cè)。PCR擴(kuò)增片段為1500bp左右。1-4，直接挑取克隆使用本試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增；5-8，挑取克隆后加入到10μl水中混勻后取3μl用于本試劑盒的PCR擴(kuò)增；9-10，本試劑盒反復(fù)凍融15次后直接挑取克隆進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。

每毫升E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)若用于50微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于40個(gè)反應(yīng)；若用于20微升的PCR反應(yīng)體系，足夠用于100個(gè)反應(yīng)。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，至少一年有效。適當(dāng)避免反復(fù)凍融。如需頻繁使用，可取適量存放于4℃，至少3天內(nèi)有效。

注意事項(xiàng)：

由于PCR反應(yīng)非常靈敏可以擴(kuò)增目的基因序列超過1000萬倍，在使用BeyoFusion™酶時(shí)請(qǐng)注意避免微量待擴(kuò)增DNA的污染，并盡量考慮設(shè)置不加模板的空白對(duì)照以確認(rèn)是否有待擴(kuò)增DNA的污染。

Taq DNA polymerase在PCR過程中每個(gè)循環(huán)的出錯(cuò)幾率約為2.2×10-5，對(duì)于大于1kb的DNA片段的克隆推薦使用出錯(cuò)幾率更低的DNA聚合酶，例如Pfu DNA polymerase、BeyoTaq DNA polymerase等。對(duì)于普通的PCR或RT-PCR進(jìn)行定性或定量檢測(cè)，Taq DNA polymerase是最佳選擇。

盡管本產(chǎn)品經(jīng)過15次反復(fù)凍融后仍具有和凍融前幾乎相同的PCR擴(kuò)增效果，但仍宜適當(dāng)避免反復(fù)凍融本產(chǎn)品，多次反復(fù)凍融可能使產(chǎn)品性能下降。

使用本產(chǎn)品前，一定要完全融化，并上下顛倒輕輕混勻后才能使用，盡量避免起泡。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.菌落直接PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.室溫融解E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數(shù)秒。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系：

注意：(a) 考慮到PCR產(chǎn)物連接涂板的時(shí)候，有部分引物可能會(huì)污染菌落，通常做菌落PCR的時(shí)候，推薦使用來自克隆載體上的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(b) 通常引物的終濃度為0.2μM時(shí)可獲得良好的檢測(cè)效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度。
c.對(duì)于要挑取的克隆在平板上做好標(biāo)記，無菌吸頭等挑取平板上對(duì)應(yīng)的克隆，加入到上述預(yù)先配制好的20µl PCR反應(yīng)體系中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
d.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil)。
e.把設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
2.菌落稀釋后檢測(cè)的PCR反應(yīng)體系的設(shè)置：
a.室溫融解E.coli Colony Direct PCR Mix (Green, 2X)，上下顛倒輕輕混勻后低速離心數(shù)秒。
b.參考下表在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)體系：

注意：(a) 考慮到PCR產(chǎn)物連接涂板的時(shí)候，有部分引物可能會(huì)污染菌落，通常做菌落PCR的時(shí)候，推薦使用來自克隆載體上的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。
(b) 通常引物的終濃度為0.2μM時(shí)可獲得良好的檢測(cè)效果，也可以根據(jù)情況在0.1-1.0μM范圍內(nèi)調(diào)整引物的終濃度。擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物的濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度。
c.挑取克隆至預(yù)先加入了10µl雙蒸水或Milli-Q水的無菌離心管中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻。
d.吸取步驟2c配制好的菌落稀釋液3μl至步驟2b配制好的17μl PCR反應(yīng)體系中，輕輕吹打混勻或輕微Vortex混勻，室溫低速離心數(shù)秒，使液體積聚于管底。
e.如果所使用的PCR儀有熱蓋則省略本步驟。如果PCR儀沒有熱蓋，則在管內(nèi)滴入一滴礦物油(ST275 Mineral oil)。
f.把設(shè)置好的PCR反應(yīng)管置于PCR儀上，開始PCR反應(yīng)。
3.PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置可以參考如下示例：
STEP1(起始變性): 94℃ 3min
STEP2(變性): 94℃ 30sec
STEP3(退火): 55℃ 30sec
STEP4(延伸): 72℃ 1min
STEP5(循環(huán)): Go To STEP2 for 30cycles
STEP6(最終延伸): 72℃ 10min
STEP7(臨時(shí)保存): 4℃ forever
注意：
a.PCR反應(yīng)的設(shè)置需根據(jù)模板、引物、PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度和GC含量等條件的不同，設(shè)定不同的PCR反應(yīng)條件包括溫度、時(shí)間和循環(huán)數(shù)等。
b.STEP4(延伸)的時(shí)間設(shè)置需根據(jù)PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度進(jìn)行設(shè)置，通常每kb產(chǎn)物的延伸時(shí)間為1分鐘。例如PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為1kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為1分鐘，PCR產(chǎn)物的長(zhǎng)度為2kb，則延伸時(shí)間可以設(shè)置為2分鐘，以此類推。
c.對(duì)于初次進(jìn)行的PCR，為盡量確保可以擴(kuò)增出預(yù)期的PCR產(chǎn)物，可以把循環(huán)數(shù)設(shè)置為35。對(duì)于需進(jìn)行半定量或定量的PCR反應(yīng)循環(huán)數(shù)一定要進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化，使PCR反應(yīng)沒有達(dá)到平臺(tái)期。
4.結(jié)果檢測(cè)：PCR結(jié)束后直接取5-10µl進(jìn)行電泳檢測(cè)，無需添加上樣緩沖液。
5.菌落的后續(xù)使用：步驟1直接挑取的菌落，可以對(duì)平板適當(dāng)培養(yǎng)后在標(biāo)記的位置再次挑取克隆后進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)和質(zhì)粒提取等；對(duì)于步驟2菌落稀釋后進(jìn)行PCR鑒定的情況，可以直接取陽性的菌液進(jìn)行擴(kuò)增培養(yǎng)和質(zhì)粒提取等。
常見問題：
a.引物設(shè)計(jì)不佳是PCR過程中最常見的問題。請(qǐng)選擇適當(dāng)?shù)囊�物設(shè)計(jì)軟件進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，注意引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在加入酶切位點(diǎn)等的引物中，一定要注意加入酶切位點(diǎn)等后整條引物的GC含量、二級(jí)結(jié)構(gòu)、二聚體、退火溫度、長(zhǎng)度、特異性等方面的問題。在原有引物效果不佳的情況并且陽性對(duì)照引物可以正常工作的情況下，可以考慮更換引物。
b.待擴(kuò)增片段GC含量偏高。GC含量較高的情況下PCR會(huì)變得相對(duì)比較困難，此時(shí)可以使用適合擴(kuò)增高GC含量DNA片段的GC-rich buffer，并相應(yīng)地根據(jù)GC-rich buffer的要求或說明調(diào)整PCR反應(yīng)參數(shù)的設(shè)置。
c.長(zhǎng)片段擴(kuò)增。盡管Taq DNA polymerase可以擴(kuò)增最長(zhǎng)達(dá)8kb的DNA片段，但大多數(shù)時(shí)候比較適合擴(kuò)增2-3kb以下的片段，更長(zhǎng)片段的擴(kuò)增推薦使用其它更適合長(zhǎng)片段擴(kuò)增的DNA聚合酶。
d.PCR反應(yīng)設(shè)置時(shí)在室溫進(jìn)行容易導(dǎo)致非特異性條件。推薦在冰浴上設(shè)置PCR反應(yīng)。
e.由于引物存在一定的二級(jí)結(jié)構(gòu)或存在一定的引物二聚體，或引物偏短，導(dǎo)致退火效果不佳。此時(shí)可以采用Touch down等方法進(jìn)行退火，通常采用從65℃逐步緩慢降溫到55℃或50℃的方法，使退火更加充分。
f.退火溫度不佳，需要優(yōu)化。如果有溫度梯度PCR儀，則可以設(shè)置退火的溫度梯度，摸索退火的最佳溫度。如果沒有溫度梯度PCR儀，則可以通過多次PCR反應(yīng)摸索最佳的退火溫度。
g.延伸時(shí)間不足�？砂凑彰�1kb片段延伸1分鐘進(jìn)行設(shè)置，對(duì)于較難擴(kuò)增的片段可以設(shè)置為每1kb片段延伸1.5-2分鐘。
h.待擴(kuò)增片段GC含量較高或長(zhǎng)度較長(zhǎng)，變性不夠充分。可以調(diào)節(jié)起始變性條件至95℃ 1min甚至95℃ 2-4min。
i.在不同PCR儀上進(jìn)行PCR反應(yīng)，避免有時(shí)PCR儀出現(xiàn)問題。
j.循環(huán)數(shù)不足，適當(dāng)延長(zhǎng)PCR的循環(huán)數(shù)。通常循環(huán)數(shù)最高不必超過40，常用的循環(huán)數(shù)范圍為25-35。
k.當(dāng)產(chǎn)生較多非特異性條帶時(shí)，可以適當(dāng)提高退火溫度。
l.注意設(shè)置適當(dāng)?shù)年栃詫?duì)照和陰性對(duì)照通常會(huì)有很大幫助。​