pShuttle-CMV-C-DsRed (腺病毒質(zhì)粒, 紅色熒光)是自行研發(fā)的用于構(gòu)建表達(dá)C端DsRed(紅色熒光蛋白)融合蛋白的重組腺病毒包裝用的穿梭質(zhì)粒。本穿梭質(zhì)粒構(gòu)建后，需要和預(yù)轉(zhuǎn)染了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)以及重組腺病毒包裝細(xì)胞配合使用才能完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle-CMV-C-DsRed質(zhì)粒可以用于在包裝成腺病毒后表達(dá)C端含DsRed (Discosoma sp. red fluorescent protein，香菇珊瑚紅色熒光蛋白)標(biāo)簽的融合蛋白。該質(zhì)粒含有CMV啟動(dòng)子，可以高效啟動(dòng)目的蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)。在多克隆位點(diǎn)的后面有一個(gè)DsRed的完整編碼序列，因此在多克隆位點(diǎn)根據(jù)閱讀框插入目的基因就可以表達(dá)C端含有DsRed標(biāo)簽的融合蛋白。利用DsRed的熒光特性可以比較容易地觀察融合蛋白的表達(dá)水平和細(xì)胞內(nèi)定位，也可以利用DsRed抗體來(lái)檢測(cè)或免疫沉淀融合蛋白。DsRed與GFP沒(méi)有序列同源性，不能使用GFP抗體檢測(cè)DsRed。
本質(zhì)粒為卡那霉素抗性。
重組腺病毒(Recombinant adenoviruses)是一種常見(jiàn)的用于在培養(yǎng)細(xì)胞或動(dòng)物體內(nèi)表達(dá)外源基因的重要工具。重組腺病毒具有感染宿主細(xì)胞范圍廣、感染不依賴細(xì)胞分裂、高滴度及目的基因表達(dá)水平高等特性。最常用的腺病毒載體是人類血清5型腺病毒。改造后的人類血清5型腺病毒，刪除了在病毒裝配過(guò)程中起關(guān)鍵作用的E1基因和非必須的能表達(dá)逃避宿主免疫的E3基因，E1和E3基因的刪除使得重組腺病毒不能自我復(fù)制，同時(shí)給外源基因的插入提供了空間，最長(zhǎng)可插入7.5kb的外源基因。從而提高了重組腺病毒的的安全性和可操作性。再利用攜帶E1基因的AD-293、293A、HEK293等細(xì)胞作為包裝細(xì)胞就可以完成重組腺病毒的包裝。
pShuttle系列的穿梭質(zhì)粒攜帶外源目的基因，經(jīng)過(guò)Pme I線性化，隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(D8106)共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中，或者轉(zhuǎn)化到已經(jīng)預(yù)轉(zhuǎn)化了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)中同源重組。BJ5183菌株表達(dá)recET基因，具有很高的基因同源重組(homologous recombination)活性，使帶有目的基因的穿梭質(zhì)粒與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1通過(guò)末端反向重復(fù)序列同源重組，實(shí)現(xiàn)外源基因與腺病毒基因組的整合。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質(zhì)粒用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝。從而制備獲得高滴度、自我復(fù)制缺陷并且?guī)в心康幕虻闹亟M腺病毒。
目的基因引入時(shí)不能含有Pme I及Pac I這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，如果含有該兩個(gè)酶切位點(diǎn)的目的基因，需要對(duì)該位點(diǎn)進(jìn)行突變方可進(jìn)行基因操作。
pShuttle-CMV-C-DsRed主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| left inverted terminal repeat | 1–103 |
| encapsidation signal (ES) | 183–331 |
| CMV promoter | 341–933 |
| multiple cloning site | 940–988 |
| DsRed | 993-1670 |
| SV40 polyA | 1690–1901 |
| Ad5 right arm homology | 1906–4160 |
| Ad5 left arm homology | 4208–5091 |
| right inverted terminal repeat | 4192–5194 |
| pBR322 origin | 5402–6069 |
| kanamycin resistance ORF | 6878–7669 |
pShuttle-CMV-C-DsRed 質(zhì)粒(8155bp)的圖譜如下：
pShuttle-CMV-C-DsRed質(zhì)粒的詳細(xì)圖譜見(jiàn)說(shuō)明書：https://www.beyotime.com/Manual/D8115 pShuttle-CMV-C-DsRed.pdf。
pShuttle-CMV-C-DsRed 中沒(méi)有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pShuttle-CMV-C-DsRed)包括：
| Acc65I | Afl II | Age I | Asc I | Asp718 |
| Blp I | BsiC I | BsiW I | BstB I | Bsu36 I |
| Cla I | Eco72 I | EcoN I | Esp I | Fse I |
| Kpn I | Nru I | Pml I | Pvu I | Sfi I |
pShuttle-CMV-C-DsRed 中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pShuttle-CMV-C-DsRed once)包括：
| SnaB I | TAC|GTA | 679 | Sca I | AGT|ACT | 1683 |
| Nhe I | G`CTAG,C | 940 | Hpa I | GTT|AAC | 1800 |
| Not I | GC`GGCC,GC | 945 | BstX I | CCAN,NNNN`NTGG | 3017 |
| BamH I | G`GATC,C | 952 | Bst1107 I | GTA|TAC | 4173 |
| Hind III | A`AGCT,T | 958 | Xca I | GTA|TAC | 4173 |
| EcoR V | GAT|ATC | 966 | Pme I | CTTT|AAAC | 4194 |
| Sal I | G`TCGA,C | 970 | EcoR I | G`AATT,C | 4199 |
| Mlu I | A`CGCG,T | 976 | Avr II | C`CTAG,G | 4741 |
| PaeR7 I | C`TCGA,G | 988 | BspH I | T`CATG,A | 6137 |
| Xho I | C`TCGA,G | 988 | Psp1406 I | AA`CG,TT | 6536 |
| Stu I | AGG|CCT | 1204 | Rsr II | CG`GWC,CG | 7542 |
| Xba I | T`CTAG,A | 1672 | Xmn I | GAANN |NNTTC | 8143 |
| Spe I | A`CTAG,T | 1678 |
pShuttle-CMV-C-DsRed 質(zhì)粒中推薦使用的測(cè)序引物序列如下：
forward primer (888-907): 5´GGTCTATATAAGCAGAGCTG3´
Reverse primer (1692-1714): 5´GTGGTATGGCTGATTATGATCAG 3´
pShuttle-CMV-C-DsRed的全序列信息:pShuttle-CMV-C-DsRed2.txt。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D8115-1µg | pShuttle-CMV-C-DsRed | 1μg |
| D8115-100μg | pShuttle-CMV-C-DsRed | 100μg |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途，也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個(gè)人或單位。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1.首次使用1µg包裝的本產(chǎn)品時(shí)，請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)�？梢酝ㄟ^(guò)酶切電泳進(jìn)行鑒定，或通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。
2.pShuttle-CMV-C-DsRed質(zhì)粒在其多克隆位點(diǎn)適當(dāng)酶切后可以插入待表達(dá)的目的基因，插入目的基因時(shí)注意與DsRed不能發(fā)生移碼突變。攜帶目的基因的質(zhì)粒經(jīng)過(guò)Pme I線性化，隨后與腺病毒骨架質(zhì)粒pAdEasy-1(D8106)共轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BJ5183中，或者轉(zhuǎn)化到已經(jīng)已經(jīng)預(yù)轉(zhuǎn)了pAdEasy-1質(zhì)粒的BJ5183菌株(D8107)中進(jìn)行同源重組。將重組的攜帶外源基因的腺病毒質(zhì)粒用Pac I線性化后轉(zhuǎn)染到AD-293、293A、HEK293等重組腺病毒包裝細(xì)胞中進(jìn)行包裝。從而制備得高滴度、自我復(fù)制缺陷并且?guī)в心康幕虻闹亟M腺病毒。
