PCR 標記的原理是用帶標記的 dNTP 進行 PCR，最后得到的 PCR 產(chǎn)物將帶有標記，可以直接用于雜交試驗。本產(chǎn)品就是基于上述原理的基礎上開發(fā)，
它具有下列特點：
1. 一站式，本試劑盒提供經(jīng)過優(yōu)化的試劑，不需要用戶自己摸索。
2. 足夠 10 次 50 uL 體系的常規(guī) PCR（用于制備標記反應的模板和設置對照反應）和 5 次 50 uL 體系的標記反應。
3. 一次標記可以得到ug級的雙鏈DNA探針或約700ng 的單鏈DNA探針，足夠多次雜交實驗用。
4. 既可用于制備雙鏈探針，也可以用于單鏈探針。
5. A 型需自備含標記核苷酸的 dNTP， B 和 C 型分別含生物素和地高辛標記的底物�？捎玫淖詡錁擞浀孜锇� fluorescein-dUTP、hydroxycoumarin-dUTP、resorufin-dUTP 和 aminoallyl-dUTP 等。
6. 摻入率一般為 4-5%，有效降低了空間阻礙，檢測效果最佳。
7. 標記探針可以用于 Southern 和 Northern Blot、原位雜交、菌落和斑點印跡雜交等分析。
8. 本產(chǎn)品足夠 5 次非標記 PCR 和 5 次標記 PCR（均指 50uL 體系）。
規(guī)格及成分：
運輸及保存： 低溫運輸，-20℃保存，有效期一年。
自備試劑 ：DNA 模板和模板專一性引物。
使用方法 一：準備工作
1. 按常規(guī)的方法設計 PCR 引物，使探針長度在 400-800bp 之間。過短則標記參入少，探針雜交信號強度減弱；過長則非特異雜交增加，背景變強。
2. 由于標記的 dNTP 比較珍貴，所以不推薦以基因組 DNA 或其他復雜 DNA為模板直接進行 PCR 標記，而是建議采取下述的兩步法標記來提高成功率，即先制備非標記 PCR 產(chǎn)物，再以之為模板制備標記的 PCR 產(chǎn)物。
3. 對 A 型標記試劑盒，四種 10mM 的 dNTP 是分開提供，用于制備 50uL非標記 dNTP（2mM each，用于非標記 PCR，用于制備標記 PCR 的模板。配制方法是四種 10mM 的 dNTP 各加 10uL，再加水 10uL 即可）
和 25uL 標記 dNTP（2mM each，其中標記核苷酸和對應的非標記核苷酸的比例需要自行優(yōu)化，假如是 biotin 或 DIG 標記的是 dUTP，則其對應的非標記核苷酸是 dTTP，兩者的最佳比例一般為 1：3；如果是BrdUTP，則兩者的最佳比例為 1：1。
配制方法是三種 10mM 的 dNTP各加 5uL，再加標記核苷酸和其對應的標記核苷酸使其總的終濃度為2mM，再補水到 25uL）。
二：非標記 PCR 產(chǎn)物的制備
4. 設置50uL非標記PCR：2×標記專用PCR Mix 25 uL，dNTP Mix（2mMeach）5uL，自備的探針引物（10pmol/uL）各 1uL，1 ug 基因組 DNA或 1ng 質(zhì)粒 DNA，補超純水到 50 uL。
5. 按已經(jīng)優(yōu)化的 PCR 參數(shù)進行常規(guī) PCR。
6. 膠回 PCR 產(chǎn)物并定量，膠回收可以避免殘留引物干擾后續(xù)的標記 PCR。
三：標記 PCR 反應（最好做一個不加標記的對照用于定量）
注意：由于雙鏈 PCR 探針在雜交時變性的雙鏈彼此還會復性，降低雜交效率，因此強烈推薦使用單鏈標記 PCR。
| 成份 | 樣品 | 非標記對照 |
| 2×標記專用PCR Mix | 25 uL | 25 uL |
| A 型：含標記核苷酸的dNTP Mix B 型：含 Biotin-11-dUTP 的 dNTP C 型：含 DIG-11-dUTP 的 dNTP |
5 uL |
不加 |
| dNTP Mix，2mM | 不加 | 5 uL |
| 若單鏈標記：加探針引物其一 | 50 pmol | 50 pmol |
| 若雙鏈標記：加探針引物一和引物二 | 各 50 pmol | 各 50 pmol |
| 膠純化所得 PCR 產(chǎn)物（單鏈標記可 用 100ng 模板） | 10 ng | 10 ng |
| 超純水 | 補到 50 uL | 補到 50 uL |
注意：本試劑盒提供的 dNTP 混合物總濃度為 2mM，所含標記 dUTP 與非標記 dTTP 的比例已經(jīng)進過優(yōu)化。
7. 按第 5 步的 PCR 參數(shù)進行標記 PCR，但需要進行下列修改：一是循環(huán)數(shù)增加到 35-55 個循環(huán)。由于模板為純化后的 PCR 產(chǎn)物，探針對擴增長度完整性要求不高（長度不均的探針由于能形成網(wǎng)絡結構，效果反而更好），
所以可以增加循環(huán)數(shù)；二是延伸時間增加 15 秒，因為標記 dUTP 參入到DNA 的速度比常規(guī)的 dTTP 慢；三是降低復性溫度 5-7℃，因為標記核苷酸參入到 DNA 后，新模板的 Tm 值將降低。
8. 標記探針的定量：取標記反應液和對照反應液 1-5 uL，在瓊脂糖凝膠上跟濃度已知的 DNA marker 一起電泳，并判斷探針的濃度。由于標記產(chǎn)物中額外帶有生物素，地高辛等、其泳動速度將慢于非標記 PCR 產(chǎn)物（但同位素標記不能用此法）。下圖是一個典型的雙鏈 PCR 產(chǎn)物電泳結果圖：
注意：如果擴增的是單鏈 DNA 探針，其結合 EB 的能力遠低于雙鏈 DNA，因此 EB 染色的強弱不能準確反應 DNA 的真實濃度，可以采用銀染定量（跟marker 比較）。一般 100ng 模板經(jīng)單鏈 PCR 擴增可得到 700ng 左右探針。
9. 剩余的 PCR 標記產(chǎn)物可以不經(jīng)過純化，直接加入（對單鏈 PCR 探針）雜或加熱變性并急冷后加入（對雙鏈 PCR 探針）到雜交液中使用。也可放-20℃長期保存。如果需要純化，請使用乙酸銨/乙醇沉淀法純化。
