研發(fā)的血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測試劑盒(ACE2 Activity Fluorometric Assay Kit)，是一種用熒光法快速高靈敏檢測血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2 (Angiotensin I Converting Enzyme 2 or Angiotensin II Converting Enzyme，簡稱ACE2)活性的試劑盒。

2019年底由新型冠狀病毒引起的肺炎疫情，從2020年初開始在全球大流行，感染病例快速上升，引發(fā)全球關注。該病毒被世界衛(wèi)生組織(WHO)命名為2019-nCoV，被國際病毒分類委員會命名為嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2 (severe acute respiratory syndrome coronavirus 2, SARS-CoV-2)。由新型冠狀病毒導致的疾病，被世界衛(wèi)生組織命名為2019冠狀病毒疾病 (Corona Virus Disease 2019, COVID-19)，通常稱為新型冠狀病毒肺炎，簡稱“新冠肺炎”。

ACE2是一種含鋅離子的金屬羧肽酶(metallocarboxypeptidase)，其結(jié)構(gòu)包括一個信號肽、一個跨膜結(jié)構(gòu)域和一個含有HEXXH鋅離子結(jié)合結(jié)構(gòu)域的金屬蛋白酶活性位點。ACE2是人血管緊張素轉(zhuǎn)換酶(Angiotensin I Converting Enzyme，簡稱ACE或ACE1)的同源基因，是在肺、心臟、腎臟和腸等組織中高表達的跨膜糖蛋白，是腎素-血管緊張素系統(tǒng)(renin-angiotensin system, RAS)的重要成員。ACE2催化Angiotensin I剪切生成九肽的血管擴張劑Ang 1-9，也可以催化Angiotensin II剪切生成七肽的血管擴張劑Ang 1-7，在調(diào)節(jié)血壓、體液平衡、炎癥、細胞增殖、肥大和纖維化的方面具有重要作用。同時，ACE2的組織和細胞的特異性表達提示其在調(diào)節(jié)心血管和腎臟功能以及生育方面發(fā)揮重要作用。此外，ACE2是冠狀病毒SARS-CoV、SARS-CoV-2 (2019-nCoV)以及HCoV-NL63的受體。SARS-CoV及SARS-CoV-2通過其Spike蛋白受體結(jié)合域(receptor binding domain, RBD)與ACE2的肽酶結(jié)構(gòu)域結(jié)合，參與病毒的感染過程。ACE2與SARS-CoV-2 Spike蛋白的親和力是SARS-CoV Spike蛋白的10-20倍。

ACE2在新冠病毒引起的疾病中，扮演了重要而復雜的角色。一方面，ACE2是新冠病毒進入細胞所識別的受體，在小鼠模型中，ACE2表達水平越高，感染就會越嚴重，因此ACE2起著幫助新冠病毒感染細胞并得以在細胞內(nèi)復制的“導火線”作用；另一方面，ACE2有一定的保護作用，如果使ACE2表達水平降低，小鼠的肺部損傷就會急劇惡化。因此，ACE2為預防和治療新冠肺炎提供了新的研究方向，ACE2蛋白作為新冠病毒感染人體、進入細胞的重要靶點已經(jīng)越來越受到關注。

血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測試劑盒采用熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)的方法，其檢測原理如下。

MCA是熒光供體(Donor)，Dnp是熒光受體(Acceptor)或稱為淬滅基團(Quencher)，這兩個熒光基團的吸收光譜有一定的重疊，當這兩個熒光基團間的距離合適時(一般7-10nm)，熒光能量由供體向受體轉(zhuǎn)移，導致供體熒光分子自身的熒光強度衰減。MCA和Dnp被連接到ACE2蛋白酶的底物(Substrate)的兩端。當ACE2沒有切割底物時，兩個基團足夠接近，發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移，即Dnp可淬滅MCA的熒光而導致檢測不到熒光；當該底物被ACE2切割后，多肽的首尾兩端分離，兩個基團分開，MCA的熒光不再被Dnp淬滅，即可檢測到MCA的熒光，這樣通過熒光檢測就可以非常靈敏地檢測ACE2蛋白酶的酶活性。MCA的最大激發(fā)波長為325nm，最大發(fā)射波長為393nm。

圖1. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測試劑盒檢測原理圖。

本試劑盒檢測靈敏度高，線性范圍寬，樣品用量少。96孔板中通常1-10μl細胞或組織樣品足夠用于ACE2酶活性檢測。

本試劑盒使用靈活，檢測速度快，適用范圍廣。本試劑盒中提供了ACE2酶陽性對照(Positive Control)，便于檢測體系的建立。本試劑盒可用于小鼠、大鼠、人等的血清、血漿以及肺、腸、肝臟等組織或細胞樣品的檢測。不僅適合少量樣本的檢測，也非常適合高通量篩選(high-throughput screening)的自動化操作系統(tǒng)。本試劑盒采用一步法檢測，簡單快速，全程約0.5-1h即可完成。

本試劑盒提供的Lysis Buffer通用性強，可直接用于裂解細胞或動物組織樣品用于檢測ACE2酶活性。

本試劑盒內(nèi)提供了MCA Standard，在0.2-50μM范圍內(nèi)有良好的線性關系�？梢酝ㄟ^設置標準曲線，計算出樣品中ACE2的活性。

用于96孔板檢測時，本試劑盒小包裝P0319S可以進行100次檢測，中包裝P0319M可以進行500次檢測。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效。其中P0319-4 Substrate、P0319-5 MCA Standard (10mM)需避光保存。

注意事項：

Assay Buffer、Substrate和MCA Standard (10mM)需完全解凍并平衡至室溫后再使用，否則會影響檢測結(jié)果。Positive Control (10X)使用時應置于冰上，使用完畢后各試劑應立即按照試劑盒要求的條件保存。

如果使用本試劑盒提供的Lysis Buffer制備樣品，并且加入的樣品量在本試劑盒的推薦范圍內(nèi)，可以確保反應體系的pH值在適宜的范圍內(nèi)。如果使用自行配制的裂解液，請確保加入樣品后反應體系的pH值在6.5-7.0之間，或者確保樣品的pH值在6.5-7.0之間，否則可能會影響檢測結(jié)果的信號值和穩(wěn)定性。

體積較小的試劑首次使用時建議先離心數(shù)秒使液體沉降于管底，然后再使用。結(jié)凍的試劑必須完全融化并混勻后使用。

盡管經(jīng)測試本試劑盒中的Positive Control (10X)反復凍融5次對活性基本沒影響，為取得良好的檢測效果，建議第一次使用時適當分裝保存。Positive Control (10X)融解后可能會有少量不溶物，屬正�，F(xiàn)象。盡量充分溶解后，離心取上清使用即可。

雖然本試劑盒中的ACE2底物有很高的特異性，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建議進一步使用ACE2特異性抑制劑MLN-4760 (SF1197)進行驗證。

檢測時建議使用96孔黑板，推薦選購全黑96孔細胞培養(yǎng)板(FCP966)。

細胞、組織等裂解樣品如果置于4℃保存，用于ACE2活性檢測時，保存的時間不應超過2天，否則會影響檢測結(jié)果的準確性。通常細胞、組織等裂解樣品宜在-20℃保存，-80℃保存更佳。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

​使用說明：
1.樣品的準備。
a.血液樣品的準備。
對于血清樣品，將全血在常溫如25℃下放置30分鐘至2小時，不要劇烈搖晃以免溶血，待全血自然凝固并析出血清后，4℃約1000-2000×g離心10分鐘，取黃色上清即得血清，注意不要吸取白色或淡黃色沉淀；對于血漿樣品，將全血用肝素或者EDTA進行抗凝，4℃約1000-2000×g離心10分鐘，取黃色或淡黃色上清即得血漿，注意不要吸取沉淀。血清和血漿都需置于冰上，如果不能立即檢測，也可以分裝并短期保存于-20℃或-80℃。對于凍存的樣品，在檢測前解凍后冰浴存放備用，使用前必須混勻。
b.細胞或組織樣品的準備。
對于培養(yǎng)的貼壁細胞，PBS (C0221A)洗滌一次并吸凈殘留液體。對于培養(yǎng)的懸浮細胞，先適當離心(如100-500×g, 5分鐘)收集細胞到離心管內(nèi)，棄上清并吸凈殘留液體。按照每100萬細胞加入100-200μl Lysis Buffer的比例加入Lysis Buffer，適當吹打，冰浴5-10分鐘以充分裂解細胞。4℃約12,000×g離心3-5分鐘，取上清用于后續(xù)檢測。對于組織樣品，按照每10mg組織加入100μl Lysis Buffer的比例進行勻漿。4℃約12,000×g離心3-5分鐘，取上清用于后續(xù)檢測。以上所有操作均需在4℃或冰上操作。制備好的細胞或組織樣品如果不能立即檢測，可以-20℃或-80℃凍存。
2.試劑盒的準備。
將Assay Buffer、Substrate和MCA Standard等試劑平衡至室溫后分別混勻備用。Positive Control (10X)存放于冰浴備用，使用完畢后宜立即按照試劑盒要求的條件保存。
3.陽性對照的準備。
取適量的Positive Control (10X)并加入Assay Buffer對Positive Control (10X)進行10倍稀釋。例如，取5μl Positive Control (10X)，加入45μl Assay Buffer，混勻，即得50μl Positive Control (1X)。96孔板檢測時，通常每孔10μl Positive Control (1X)即可。
4.MCA標準曲線的設置。
取2μl MCA Standard (10mM)，加入198μl Assay Buffer，混勻，即為200μl 100μM的MCA溶液，分別取0、2.5、5、10、20、30、40、50μl的100μM MCA溶液加入96孔板中，并用Assay Buffer補足至100μl，此時，MCA標準曲線的各孔MCA濃度和物質(zhì)的量分別為0、2.5、5、10、20、30、40、50μM或0、0.25、0.5、1、2、3、4、5nmol。也可自行設置適宜的MCA濃度進行標準曲線的設定。
5.檢測體系的設置：
參照下表依次加入試劑盒各組分及樣品。初次檢測時，待測樣品可以稀釋一系列濃度梯度，以確保最終檢測值在標準曲線線性范圍內(nèi)。待測樣品的稀釋倍數(shù)記為dil。

注：為獲得更加可靠的檢測結(jié)果，推薦每個樣品設置3個復孔。
6.檢測。
a.振蕩混勻1-2分鐘，確保混合充分。
b.除MCA標準曲線外每孔加入2μl Substrate，混勻。注：加入Substrate后反應會立即開始，如果孔數(shù)較多的情況下，建議在低溫或使用排槍操作以減小各孔間加入Substrate的時間差而導致的誤差，混勻操作可在培養(yǎng)板振蕩器上進行。
c.混勻后立即使用熒光酶標儀進行熒光測定。設置熒光酶標儀溫度為37℃，激發(fā)波長為325nm、發(fā)射波長為393nm，每5分鐘或10分鐘讀取一次數(shù)值。
注1：連續(xù)測定的時間可以根據(jù)待測樣品中ACE2的酶活性進行調(diào)整，但是需確保獲得6個點以上的數(shù)據(jù)。對于ACE2的酶活較高的樣品，建議測定總時間為20分鐘或30分鐘，對應的測定間隔時間設為2分鐘或5分鐘；對于ACE2的酶活很低的樣品，可以延長測定總時間為1至2小時，對應的測定間隔時間設為10或20分鐘。
注2：如果熒光酶標儀沒有溫控功能，也可以在室溫測定，但這樣檢測出來的是室溫條件下的酶活性，此時酶活性可能會偏低一些，不同的實驗條件偏低的程度會有所不同。
7.計算。
a.計算每個樣品孔和空白對照孔的平均熒光值，可分別記錄為RFU空白對照、RFU陽性對照和RFU待測樣品。RFU，Relative Fluorescence Unit。選取待測樣品組MCA熒光強度呈線性關系的時間點的數(shù)據(jù)用于分析，記錄呈線性關系的時間間隔為T，時間間隔T內(nèi)的熒光強度變化量為ΔRFU，即ΔRFU= RFU待測樣品(Time b) - RFU待測樣品(Time a)。
b.也可以直接比較各個樣品在一定時間內(nèi)的ΔRFU而確定樣品的ACE2相對活性，但須確保最終時間點時RFU讀數(shù)未達平臺。
c.也可將標準曲線各孔的熒光值減去標準品零濃度孔的熒光值，建立MCA標準曲線。將ΔRFU代入標準曲線，即可算出在反應時間內(nèi)樣品中MCA的生成量(記錄為A)。MCA的標準曲線請參考圖2A，MCA在0.02-5nmol (即0.2-50μM)范圍內(nèi)有良好的線性關系。ACE2蛋白酶活性的計算公式如下：
ACE2 Activity (nmol/min/mg或U/mg) = A× dil/ (Vsample × T × C)
注：Vsample為檢測時待測樣品的體積(Vsample=10μl =0.01ml)；
A為步驟7c根據(jù)標準曲線確定的MCA的生成量(nmol)；
dil為步驟5中樣品稀釋倍數(shù)；
C為樣品蛋白濃度(mg/ml，檢測步驟參考BCA蛋白濃度測定試劑盒或去垢劑兼容型的Bradford蛋白濃度測定試劑盒)；
T為步驟7a中反應時間(min)。
酶活力單位的定義為：溫度37℃條件下，每分鐘催化生成1nmol MCA酶量定義為一個單位(Unit, U)。
d.雖然本試劑盒中的ACE2底物已經(jīng)比較特異，但仍然有可能有一些蛋白酶可以切割本底物，建議進一步使用ACE2特異性抑制劑MLN-4760 (SF1197)進行驗證。
圖2. 血管緊張素轉(zhuǎn)換酶2(ACE2)活性熒光檢測試劑盒的MCA標準曲線和對ACE2陽性對照及組織樣品的檢測效果圖。A. 本試劑盒的MCA標準曲線示意圖。B. 不同量的ACE2 Positive Control (1X)酶切底物，生成產(chǎn)物的熒光強度示意圖。C. 小鼠不同組織的ACE2酶活性檢測效果及MLN-4760的抑制效果�？偟鞍琢慷紴�10μg，抑制劑為MLN-4760 (SF1197)，終濃度為500nM)。D. ACE2 Positive Control (1X，10μl)及抑制劑MLN-4760 (終濃度為500nM)在293T細胞裂解液中的檢測效果(總蛋白量為22μg)。實際檢測數(shù)據(jù)會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。​