植物原生質(zhì)體制備及轉(zhuǎn)化試劑盒

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

植物原生質(zhì)體是指脫去全部細(xì)胞壁由質(zhì)膜包被的具有生命活力的裸露細(xì)胞。它具有細(xì)胞生命特征和全能型，是細(xì)胞無(wú)性系變異和突變體篩選的重要來(lái)源，同時(shí)也是植物遺傳工程的理想受體 和遺傳改良的理想材料。酶解法分離原生質(zhì)體是一個(gè)常用的技術(shù)，其原理是植物細(xì)胞壁主要由纖維素、半纖維素和果膠質(zhì)組成，因而使用纖維素酶、半纖維素酶、離析酶和果膠酶能降解細(xì)胞壁成分，去除細(xì)胞壁，即可得到原生質(zhì)體。許多方法可誘導(dǎo)原生質(zhì)體融合，現(xiàn)在被廣泛采用的融合方法是聚乙二醇 (PEG) 法。聚乙二醇 (PEG)作為一種高分子化合物，合適的濃度能對(duì)原生質(zhì)體產(chǎn)生瞬間沖擊效應(yīng)，原生質(zhì)體很快發(fā)生收縮與粘連，隨后用高鈣高pH法進(jìn)行清洗，使原生質(zhì)體 融合得以完成。

按照每次使用5 ml酶消化體系計(jì)算，本試劑盒可用于40次酶消化反應(yīng)。本試劑盒每個(gè)5 ml反應(yīng) 體系可處理0.1 g左右的擬南芥葉片(約10~15葉片),操作較好的情況下每5 ml 體系可獲得約50-70 萬(wàn)個(gè)原生質(zhì)體(不同植物不同操作會(huì)有一定的差異),可滿足約25-70個(gè)樣品的原生質(zhì)體質(zhì)粒轉(zhuǎn)染操 作(按照每樣1-2萬(wàn)個(gè)細(xì)胞計(jì)算)。原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化時(shí)，按照每次轉(zhuǎn)化100 μl原生質(zhì)體溶液，轉(zhuǎn)化試劑可以完成至少40個(gè)樣品的轉(zhuǎn)化。

試劑盒組成：

貯存和運(yùn)輸：

-20℃保存，至少一年有效。

組分4℃存放3-5天不會(huì)影響使用效果，長(zhǎng)期不用則需按照標(biāo)簽溫度貯存。

試劑盒冷藏運(yùn)輸。

使用說(shuō)明：

需要準(zhǔn)備的材料(試劑盒不提供):

剪尖吸頭(剪尖后可以用酒精燈過(guò)火將吸頭處理平滑);纖維素酶R-10; 離 析 酶R-10; 平頭鑷子；70 μm細(xì)胞過(guò)濾篩； 一次性刀片；50 ml離心管；1.5 ml離心管；水浴鍋。

一 、原生質(zhì)體分離：

即用型酶溶液配制

注：即用型酶溶液現(xiàn)用現(xiàn)配，不建議配制后凍存后再使用； 溶解好的正常酶溶液應(yīng)為澄清棕黃色溶液,如使用純度不好的酶，溶液為不溶解的乳白色懸濁液，不能使用。

1.1酶解：

取生長(zhǎng)狀態(tài)良好的葉片切成0.5-1 mm 的小條，按照0.1 克葉片(擬南芥約15-20個(gè)葉片)加5 ml  即用型酶溶液的比例迅速將切割好的葉片小條浸泡于酶溶液中，避光，無(wú)需震蕩，常溫(20-25℃) 酶解3小時(shí)，間歇混勻。

注：酶解時(shí)間與葉片種類，葉片生長(zhǎng)狀態(tài)有關(guān)，請(qǐng)根據(jù)實(shí)驗(yàn)需要適當(dāng)調(diào)整酶解時(shí)間。3小時(shí)為擬南芥葉片推薦的酶解 時(shí)間。如條件允許，可以使用微型真空泵常溫避光條件下抽真空30 min, 以使酶溶液更好地進(jìn)入細(xì)胞間隙。酶溶液變 為綠色表明有原生質(zhì)體已經(jīng)有分離，溶液為濃綠色表明原生質(zhì)體已經(jīng)大量分離(左下圖)。擬南芥原生質(zhì)體大小約為30-50μm,顯微鏡鏡檢后確定是否分離。葉片原生質(zhì)體細(xì)胞顯微鏡下為綠色圓球狀，葉綠體分散在整個(gè)細(xì)胞內(nèi),說(shuō)明狀態(tài)較好；如呈現(xiàn)不規(guī)則形狀，說(shuō)明原生質(zhì)體破碎或即將破碎。

1.2漂洗：

酶解后加入等體積的溶液IⅡ,如使用5 ml酶解體系，加入5 ml溶液Ⅱ,輕柔混勻。

1.3過(guò)濾：

用孔徑70 μm篩網(wǎng)(自備)過(guò)濾步驟2中的溶液，去除未消化的葉片，用5-10 ml溶液Ⅱ沖洗酶解器 皿和未消化的葉片1-2次，將所有的液體收到50 ml離心管中。

1.4第一次收集：

濾出液100 g 常溫離心2分鐘，盡量去除上清。

注：為了避免原生質(zhì)體離心時(shí)貼在管壁，建議整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程使用水平轉(zhuǎn)頭；離心時(shí)，可調(diào)低離心機(jī)的升速和降速。

升速過(guò)快，原生質(zhì)體可能離到管壁上；降速過(guò)快，可能導(dǎo)致管底原生質(zhì)體懸起。建議升速和降速分別都使用3。

1.5第二次收集：

加入2-5 ml 溶液Ⅱ,用剪尖的藍(lán)吸頭重懸原生質(zhì)體，冰浴30分鐘，原生質(zhì)體在重力作用下可以沉 降到離心管底部，盡量吸除上清，收集原生質(zhì)體。(如果發(fā)現(xiàn)原生質(zhì)體沉降的速度比較慢或者得 率比較低，也可以考慮常溫100 g 離心1-2 min收集原生質(zhì)體)。

1.6重懸：

小心去除上清溶液，不要觸動(dòng)原生質(zhì)體沉淀，沉淀用剪尖的藍(lán)吸頭重懸于1 ml溶液Ⅲ中即為原生 質(zhì)體溶液。(可以用血球計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)，根據(jù)原生質(zhì)體數(shù)量調(diào)整溶液Ⅲ的加入體積，使得原生質(zhì)體 密度為2×105/ml或更高)。

注：制備好的原生質(zhì)體可以在4℃或冰浴保存至少24 h。

二 、原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和培養(yǎng)：

2.1轉(zhuǎn)化溶液配制：

植物原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化參考下表根據(jù)樣品量配制轉(zhuǎn)化溶液。

注：轉(zhuǎn)化溶液現(xiàn)用現(xiàn)配。轉(zhuǎn)化溶液需要在轉(zhuǎn)化前至少1小時(shí)配制，以確保轉(zhuǎn)化試劑溶解充分。轉(zhuǎn)化溶液配制后盡量 當(dāng)天使用。配制好的轉(zhuǎn)化溶液4℃保存3-5天之內(nèi)仍然有較好的轉(zhuǎn)化效率，但和當(dāng)天配制的轉(zhuǎn)化溶液相比，轉(zhuǎn)化效果 可能會(huì)有一定程度的下降。

2.2準(zhǔn)備質(zhì)粒：

取10 μl 質(zhì)粒DNA(10-20   μg,濃度為1-2 μg/μl)于1.5 ml 離心管中。

 注：質(zhì)粒大小建議為5-10 kb, 質(zhì)粒濃度為1-2 μg/μl左右；

原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化對(duì)于質(zhì)粒的純度要求較高，盡量使用高純度的質(zhì)粒。

2.3質(zhì)粒轉(zhuǎn)化：

2.3.1質(zhì)粒管中加入100 μl原生質(zhì)體溶液(原生質(zhì)體密度為2×105/ml,約2萬(wàn)個(gè)原生質(zhì)體),輕柔混勻。

2.3.2加入等體積即110 μl 步驟1事先準(zhǔn)備好的轉(zhuǎn)化溶液，輕彈管底，混勻，常溫25℃放置5-15分鐘。 注：最長(zhǎng)可以孵育15 min, 但通常孵育5 min 時(shí)間已經(jīng)足夠。最佳的孵育時(shí)間對(duì)于不同的原生質(zhì)體和不同的質(zhì)粒需 要通過(guò)實(shí)驗(yàn)摸索。

2.4終止轉(zhuǎn)化：

加入2倍體積即440 μl溶液Ⅱ,輕柔徹底混勻，終止轉(zhuǎn)化過(guò)程。

2.5收集原生質(zhì)體：

常溫100 g 離心1-2分鐘，盡量去除上清。

注：由于轉(zhuǎn)化后的溶液會(huì)非常粘稠，加入溶液II后離心1 min 通�？梢允乖�生質(zhì)體聚集在管底，但使用某些突變體時(shí) 為減少原生質(zhì)體損失，可將離心時(shí)間延長(zhǎng)到2 min。

2.6原生質(zhì)體漂洗：

加入500 μl溶液IⅡ輕輕重懸原生質(zhì)體，常溫100g離心1 min,  盡量去除殘留的上清。

注：本步驟可以充分去除殘留的轉(zhuǎn)化試劑溶液中的組分，避免轉(zhuǎn)化試劑溶液中的組分對(duì)于后續(xù)的不良影響。

2.7原生質(zhì)體重懸：

沉淀中加入1 ml 溶液V,  輕柔重懸。

2.8原生質(zhì)體培養(yǎng)：

將離心管水平放置，23-25℃弱光培養(yǎng)。

注：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求確定孵育時(shí)間。RNA分析孵育2-6小時(shí)；酶活性分析和蛋白標(biāo)記實(shí)驗(yàn)孵育2-16小時(shí)；基因編輯的 效果在轉(zhuǎn)染24小時(shí)后可能被檢測(cè)到。