產(chǎn)品組成：Plant Rubisco Assay Kit
| 組分貨號(hào) | 名稱 | 規(guī)格 | 貯存 | 運(yùn)輸 |
| PU1060-01 | 試劑1-Rubisco提取緩沖液（2×） | 100 ml | 4℃ | 常溫 |
| PU1060-02 | 試劑2-10×Assay buffer | 15 ml | -20℃ | 常溫 |
| PU1060-03 | 試劑3-GAPDH（200×） | 1 KU/1ml | -20℃ | 常溫 |
| PU1060-04 | 試劑4-PGK（100×） | 500 U/1ml | 4℃ | 常溫 |
| PU1060-05 | 試劑5-CPK（100×） | 1 KU/1ml | -20℃ | 常溫 |
| PU1060-06 | 試劑6-ATP（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常溫 |
| PU1060-07 | 試劑7-CrP（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常溫 |
| PU1060-08 | 試劑8-NADH（100×） | 1.2 ml | -20℃ | 常溫 |
| PU1060-09 | 試劑9-RuBP | 1.4 ml×2 | -20℃ | 常溫 |
| PU1060-10 | 試劑10-酶溶解緩沖液 | 5 ml | -20℃ | 常溫 |
| DE005 | 試劑11-滅菌水 | 100 ml | 4℃ | 常溫 |
| BSA-02 | 試劑12-BSA溶液 50mg/ml | 5 ml | -20℃ | 常溫 |
| DT0140P | 試劑13-1MDTT（100×） | 1 ml×2 | -20℃ | 常溫 |
| PC2030-01 | 蛋白酶抑制劑 植物樣品提取用(100×) | 1 ml | -20 | 常溫 |
● 產(chǎn)品簡(jiǎn)介：
核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(Rubisco)是光合作用碳代謝中的重要的調(diào)節(jié)酶，是植物中最豐富的蛋白質(zhì)，主要存在于葉綠體的可溶部分，總量約占葉綠體可溶蛋白50％～60％。
這里1分子CO2被固定，就有2分子 NADH 被氧化。因此，由NADH氧化的量就可計(jì)算Rubisco的活性，由340nm吸光度的變化可計(jì)算NADH氧化的量。
為了使NADH的氧化與CO2的固定同步，需要加入磷酸肌酸(CrP)和磷酸肌酸激酶(CPK)的ATP再生系統(tǒng)。
按照1 ml 反應(yīng)體系計(jì)算，該試劑盒可以測(cè)定80-100個(gè)樣品。
● 自備材料：
植物材料；剪刀；液氮；研缽或其他研磨設(shè)備；1.5ml離心管；1ml石英比色皿；紫外分光光度計(jì)；制冰機(jī)；低溫離心機(jī)
● 操作步驟：
一、 即用型Rubisco提取緩沖液配制：
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| 一個(gè)反應(yīng)配制體積 | n個(gè)反應(yīng)配制體積 |
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| 1 ml | n×1 ml |
| Rubisco提取緩沖液（2×） | 0.5 ml | n×0.5 ml |
| 滅菌水 | 470 μl | n×470 μl |
| 1 M DTT（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| BSA溶液50mg/ml | 20 μl | n×20μl |
| 蛋白酶抑制劑（100×） | 10 μl | n×10μl |
注：1. 即用型Rubisco提取緩沖液盡量現(xiàn)配現(xiàn)用，短期4℃中可以過夜保存。
2. 為增強(qiáng)Rubisco的穩(wěn)定性，提取緩沖液中可以加入蛋白酶抑制劑（Cat：PC2030）
二、 Rubisco樣品提�。�
1. 取新鮮植物組織，清洗干凈，擦干，液氮中研磨，1 cm2葉片（1分硬幣大�。┗�0.1g粉末加入1 ml 即用型Rubisco提取緩沖液，顛倒混勻，冰浴放置5-10分鐘。
2.12000g4℃離心 10分鐘，上清即為Rubisco樣品提取液，常溫放置備用（不要冰浴或4℃放置，常溫放置可以保持Rubisco活性）。
注：Rubisco樣品提取液最好立即測(cè)定，不建議保存。
三、 Rubisco活性測(cè)定分析：
1. 即用型酶溶解緩沖液配制：
按照標(biāo)簽所示，在試劑10-酶溶解緩沖液原瓶中加入1.5 ml滅菌水和1 ml BSA溶液（50mg/ml），混勻后即配成即用型酶溶解緩沖液，冰浴備用，-20℃保存。
2. 試劑3-GAPDH和試劑5-CPK按照標(biāo)簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
3. 試劑4-PGK為硫酸銨懸浮液，4℃12000g離心5分鐘，去除上清（小心去除，可以保留少許上清，不要吸棄沉淀），沉淀中按照標(biāo)簽所示加入即用型酶溶解緩沖液，混勻溶解后冰浴備用，-20℃保存。
4. 試劑9-RuBP：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：RuBP溶液穩(wěn)定性較差，用后-20℃保存，有效期3-4天，長(zhǎng)期-80℃保存。
5. 試劑8-NADH：按照標(biāo)簽所示加入滅菌水，徹底混勻后冰浴備用。
注：NADH穩(wěn)定性較差，用后-20℃貯存3-4天，長(zhǎng)期-80℃保存。
6. 反應(yīng)體系MasterMix配制：
| 加入順序 | 組份 | 1ml反應(yīng)體系加入量 | MasterMix配制 （測(cè)定n個(gè)樣品為例） |
| 1 | 10×Assay Buffer | 100 μl | n×100μl |
| 2 | 滅菌水 | 795μl | n×795μl |
| 3 | ATP溶液（100×） | 10 μl | n×10μl |
| 4 | CrP溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 5 | GAPDH溶液（200×） | 5 μl | n×5 μl |
| 6 | PGK溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 7 | CPK溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
| 8 | NADH溶液（100×） | 10 μl | n×10 μl |
7. 反應(yīng)體系測(cè)定；
1.5 ml離心管中配制以下反應(yīng)。
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| 1 | 2 | 3 |
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| 對(duì)照反應(yīng) | 初始活性測(cè)定 | 總活性測(cè)定 |
| MasterMix | 950 μl | 950 μl | 950 μl |
| 即用型Rubisco提取緩沖液 （步驟一） | 25 μl | - | - |
| Rubisco樣品提取液 （步驟二） | - | 25μl | 25μl 常溫放置15分鐘 |
| 試劑9-RuBP溶液 | 25 μl | 25 μl | 25μl |
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| 加入RuBP后立即測(cè)定OD340讀數(shù)，記錄60秒內(nèi)OD340值變化。 | |
注：一般分光光度計(jì)OD340讀數(shù)在0.5-3之間數(shù)據(jù)比較準(zhǔn)確，低于此范圍說明提取用的材料太少，Rubisco活性太低；高于此范圍說明所用材料太多，Rubisco活性太高，此時(shí)可以將Rubisco樣品提取液用即用型Rubisco提取緩沖液稀釋后測(cè)定。
四、Rubisco活性計(jì)算：
根據(jù)如下公式計(jì)算樣品中Rubisco活初始性和總活性：
Activity（μmol·m-2·S-1）-表示每秒每平方米葉片有多少μmol NADH被氧化
△A-反應(yīng)最初1分鐘內(nèi)340nm處測(cè)定管吸光度變化的絕對(duì)值
N-稀釋倍數(shù)，本程序中為40（1 ml提取液，取25μl測(cè)定）。
6.22-每微摩爾NADH在340nm處的吸光系數(shù)
d-cm 比色皿光程，一般為1
△t-秒 測(cè)定時(shí)間，本程序?yàn)?0秒
S-cm2 提取時(shí)使用的葉面積
