發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (Luminescent Mycoplasma Detection Kit for Low Sensitivity Instrument)，簡稱或MycoLumi™，是一種通過化學(xué)發(fā)光法檢測培養(yǎng)的細胞等生物材料中是否有支原體污染的試劑盒。

發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)的用途與的同類產(chǎn)品發(fā)光法支原體檢測試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)相同，性能略有不同，具體請參考下表。兩種產(chǎn)品根據(jù)使用儀器的靈敏度對發(fā)光法支原體檢測試劑盒進行了一定的改良，使檢測試劑盒更適合相應(yīng)的檢測儀器。在相同檢測儀器條件下，發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)的讀值更高，一般為發(fā)光法支原體檢測試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)的10-50倍，所以發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)更適合于低靈敏度、相對低讀值的化學(xué)發(fā)光儀，例如Molecular Devices的SpectraMax® M3等儀器，該類儀器的讀值較低，使用低靈敏度儀器專用的檢測試劑盒可確保檢測時可獲得良好的化學(xué)發(fā)光讀數(shù)。發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)也可用于高靈敏度的儀器，此時讀值比較高，但對支原體的檢測靈敏度略差一些，即陽性樣品的比值會低一些。而發(fā)光法支原體檢測試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)更適合于高靈敏度、相對高讀值的化學(xué)發(fā)光儀，例如ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan Flash/Varioskan LUX等儀器，該類儀器的讀值較高，使用高靈敏度儀器專用的檢測試劑盒可使對于支原體的檢測靈敏度更高。發(fā)光法支原體檢測試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)與Lonza公司的MycoAlert™ Mycoplasma Detection Kit相似，而發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)與Lonza公司的MycoAlert™ PLUS Mycoplasma Detection Kit相似。發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)對支原體的檢測靈敏度略低于發(fā)光法支原體檢測試劑盒(高靈敏度儀器用) (C0298)，具體表現(xiàn)為陽性樣品的比值會低一些，但仍可滿足常規(guī)的檢測需求。兩種試劑盒的比較和選擇請參考下表：

支原體(Mycoplasma)是最小、最簡單的原核生物。支原體有如下特征：支原體無細胞壁結(jié)構(gòu)，所以針對細胞壁的許多常見的抗生素，如青霉素或β-內(nèi)酰胺類抗生素對支原體無效；支原體大小介于細菌和病毒之間，約為0.2-0.8μm，所以部分支原體可通過0.22μm濾器，常規(guī)的過濾對支原體無效；很多支原體由于自身的生物合成能力有限而依靠宿主提供營養(yǎng)，所以通常吸附或散落在細胞表面和細胞之間。支原體的這些特征使細胞培養(yǎng)過程中存在支原體污染的風(fēng)險，細胞的支原體污染已經(jīng)成為一個世界性的普遍問題。支原體污染可能會嚴(yán)重影響細胞的狀態(tài)，使細胞的基因表達、代謝特征發(fā)生變化，導(dǎo)致細胞生長減緩、分化和死亡異常，嚴(yán)重影響細胞功能。這些影響因素會嚴(yán)重影響實驗結(jié)果的可靠性、可重復(fù)性和一致性，因此支原體污染的檢測非常重要。

細胞培養(yǎng)過程中的細菌、酵母或霉菌污染在光學(xué)顯微鏡下可見，但支原體污染在光學(xué)顯微鏡下通常不可見，必須通過特定的檢測方法進行檢測。檢測支原體污染的常用方法有支原體分離培養(yǎng)、ELISA、特殊的生化檢測、PCR檢測以及DNA熒光染色檢測等。上述檢測方法中，大多操作步驟相對比較煩瑣、靈敏性不高或所需時間較長。

發(fā)光法支原體檢測試劑盒是利用支原體特有酶的活性并通過ATP依賴的螢光素酶催化的發(fā)光反應(yīng)進行檢測，通過比較檢測試劑加入前后ATP量的變化來確定樣品是否有支原體污染。整個檢測過程只有兩個步驟，僅需約15分鐘。第一步是在樣品中加入支原體檢測試劑A，5分鐘后進行檢測，讀值為A，此時檢測的是樣品中原有ATP的量；第二步是加入支原體檢測試劑B，10分鐘后進行檢測，讀值為B，此時如果樣品有支原體污染，其特有的酶可以將支原體檢測試劑B中的ADP轉(zhuǎn)換為ATP，此時檢測的就是原有的本底ATP量和由支原體特有酶催化新生成的ATP量的總和。通過計算讀值B與A的比值就可以判斷是否有支原體污染。如果比值大于1.2表示有支原體污染，比值越大說明污染程度越高，如果比值小于0.9說明沒有支原體污染，如果比值介于0.9和1.2之間，建議原細胞(包含原培養(yǎng)液)繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時之后再測試一次。本試劑盒檢測支原體的原理參考圖1。

圖1. 發(fā)光法支原體檢測試劑盒檢測支原體的原理。細胞上清中如果含有支原體，加入支原體檢測試劑A后會裂解支原體，支原體中的內(nèi)容物釋放，釋放出的ATP以及細胞上清中的ATP會在螢光素酶催化下產(chǎn)生螢光信號；加入支原體檢測試劑B之后，支原體中特有的酶可以使ADP轉(zhuǎn)換成ATP，生成的ATP可以跟檢測試劑中的螢光素酶反應(yīng)，產(chǎn)生的螢光信號進一步增加。

本試劑盒可快速、有效、高靈敏度地檢測支原體污染，在細胞培養(yǎng)過程中可隨時取少量培養(yǎng)液上清監(jiān)測是否有支原體污染。

本試劑盒螢光信號穩(wěn)定性好，在加入支原體檢測試劑A后，螢光信號穩(wěn)定，在5分鐘時即可檢測；加入支原體檢測試劑B后，如果是無支原體污染樣品，原有螢光信號會有一定程度的下降，而如果是有支原體污染樣品，螢光信號會隨時間延長而增強，10分鐘時即可檢測。

如果發(fā)現(xiàn)有支原體污染，建議更換無污染的細胞進行培養(yǎng)。如果有必要預(yù)防或去除支原體，可以使用專用的支原體預(yù)防或去除試劑。

本試劑盒包含一定量陽性對照，檢測更可靠、便捷。陽性對照不含支原體，無支原體污染風(fēng)險。建議每次檢測都設(shè)置陽性對照。陽性對照也可單獨訂購(C0299 發(fā)光法支原體檢測陽性對照)。

對于96孔板，推薦使用50μl細胞培養(yǎng)液或其它樣品，此時本試劑盒C0297S包裝可檢測20個樣品，C0297M包裝可檢測100個樣品。

包裝清單：

保存條件：

-20℃保存，一年有效；-80℃保存，兩年有效。支原體檢測試劑A (C0297S-1或C0297M-1)需避光保存。

注意事項：

對于首次使用本試劑盒，不確定儀器是低靈敏度或高靈敏度時，建議先訂購C0298S，如果讀數(shù)超過1萬，基本是高靈敏度儀器，后續(xù)可選擇C0297；或者同時訂購C0297S和C0298S，進行實際比較后確定后續(xù)的選擇。

發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用) (C0297)也可用于高靈敏度的儀器，此時讀值比較高，但對支原體的檢測靈敏度略差一些，不建議用于低靈敏度儀器，此時讀值可能會比較低，使檢測出來的數(shù)據(jù)無法反映真實的支原體污染情況。

支原體檢測試劑A中含有螢光素酶，反復(fù)凍融會導(dǎo)致其逐漸失活。盡管經(jīng)測試反復(fù)凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，為取得良好的使用效果，第一次解凍后可適當(dāng)分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。反復(fù)凍融過程中，可能會導(dǎo)致檢測試劑中出現(xiàn)少量沉淀，此時宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經(jīng)測試不會影響后續(xù)的檢測效果。

陽性對照須避免反復(fù)凍融，可適當(dāng)分裝后保存。

檢測時強烈建議使用白色96孔板，如果使用普通透明的96孔板，相鄰孔之間可能會產(chǎn)生相互干擾。

當(dāng)檢測對象是細胞時，需正常培養(yǎng)細胞至少24小時以上，3-6天更佳，然后直接使用未經(jīng)胰酶消化的細胞培養(yǎng)液上清作為樣品；當(dāng)檢測對象是一些支原體含量極其微量的樣品時，如細胞培養(yǎng)用的血清、胰酶、抗生素、培養(yǎng)液，最好經(jīng)過2-3天的培養(yǎng)后再測試。培養(yǎng)時間過短，很可能會導(dǎo)致本產(chǎn)品無法檢測出支原體污染。如果只能培養(yǎng)較短時間，建議嘗試用支原體PCR檢測試劑盒(C0301)或其它方法進行檢測。

由于某些貼壁細胞培養(yǎng)液上清中有少量細胞或?qū)τ趹腋〖毎�的培養(yǎng)液，室溫200×g離心5分鐘后取上清檢測，否則背景值會比較高。

檢測時請在室溫20-25℃左右進行，否則會影響檢測效果。化學(xué)發(fā)光反應(yīng)和支原體特異性酶催化的反應(yīng)都受溫度影響，檢測試劑、檢測樣品都必須平衡至室溫才可以進行檢測。

人體皮膚表面有豐富的ATP，檢測時請戴好手套，防止污染試劑。其它耗材也需潔凈、無污染。

本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。

為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。

使用說明：
1.需要用戶自己準(zhǔn)備的器材：
a.化學(xué)發(fā)光儀(luminometer)或者具有檢測化學(xué)發(fā)光功能的酶標(biāo)儀、和酶標(biāo)儀配套使用的化學(xué)發(fā)光檢測專用的96孔板(白板)。
b.無菌離心管、槍頭及移液槍。
2.試劑和檢測樣品準(zhǔn)備：
a.所有試劑使用前要平衡至室溫，最適宜的溫度是20-25℃。
b.檢測樣品準(zhǔn)備：取0.2-1ml培養(yǎng)3-6天的細胞上清(培養(yǎng)時間較短的細胞上清也可以檢測，但上清中釋放的支原體較少，檢測靈敏度會顯著下降)，200×g (約1500rpm)離心5分鐘以沉淀少量漂浮的細胞或細胞碎片，取上清。上清樣品最好收集后立即檢測，也可以在室溫或4℃放置并當(dāng)天檢測，或者置于-80℃保存半年內(nèi)檢測。低溫保存的樣品檢測的時候須室溫融化并達到室溫后才可用于檢測。
3.實驗步驟：
a.在檢測板中加入50μl的檢測樣品、陽性對照、陰性對照(如無菌水或PBS、新鮮培養(yǎng)液)。
b.加入50μl的支原體檢測試劑A，混勻，20-25℃放置5分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進行化學(xué)發(fā)光檢測，即讀值為A。請根據(jù)儀器要求設(shè)置相應(yīng)的參數(shù)，每個孔的檢測時間一般為0.25-1秒或更長時間，具體需根據(jù)儀器的檢測靈敏度進行適當(dāng)?shù)恼{(diào)整。
c.加入50μl的支原體檢測試劑B，混勻，20-25℃放置10分鐘。然后用多功能酶標(biāo)儀進行化學(xué)發(fā)光檢測，即讀值為B。注：請嚴(yán)格按照加入支原體檢測試劑B后10分鐘進行檢測，切勿提前或延后，否則可能會影響比值在臨界值附近樣品的結(jié)果判斷。
d.計算比值(Ratio)=讀值B/讀值A(chǔ)。參考表1，比值大于1.2說明有支原體污染，比值小于0.9表示沒有支原體污染，比值在0.9-1.2之間可以將原樣品繼續(xù)培養(yǎng)24-48小時后重新檢測。
表1. 發(fā)光法支原體檢測試劑盒的結(jié)果分析。

備注1：有些樣品如添加了特殊藥物或使用某些特殊培養(yǎng)液，可能含有抑制或增強反應(yīng)的成分而導(dǎo)致假陰性或假陽性，此時可以將樣品稀釋10倍后再進行檢測，并進一步根據(jù)稀釋后測定出來的B/A比值來判定是否有支原體污染。
備注2：本試劑盒可以檢測出常見的44種支原體污染(具體見附錄)，但是不能具體區(qū)分是何種支原體污染。如需鑒定污染支原體種類，請選用支原體PCR檢測試劑盒(C0301)。
e.本試劑盒用ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX檢測一些常見樣品的示例結(jié)果請參考表2。陽性對照(Positive Control)為試劑盒中提供的陽性對照，常用溶劑(Common Solvents)為超純水(Water)和PBS，常用細胞培養(yǎng)液(Common Culture Medium)為RPMI-1640和DMEM，陽性樣品(Positive Samples)為支原體污染的HeLa細胞培養(yǎng)上清(其中10倍稀釋為按1:9用PBS稀釋)，陰性樣品(Negative Samples)為無支原體污染的BEAS-2B和293T細胞培養(yǎng)上清。本試劑盒提供的陽性對照，由于反復(fù)凍融導(dǎo)致部分失活等因素，實際測定出來的比值可能會和表2和圖2中所列數(shù)據(jù)有較明顯的偏差。而超純水、PBS、RPMI-1640和DMEM檢測出來的比值數(shù)據(jù)和所列數(shù)據(jù)會相對比較接近。實際測定出來的讀值A(chǔ)和B，不同的儀器設(shè)備可能會有非常大的差別。
表2. 發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測數(shù)據(jù)示例。注：ThermoFisher的多功能酶標(biāo)儀Varioskan LUX為高靈敏度儀器，所以讀值較高，實際在低靈敏度儀器中，讀值可能在幾十至上千。

圖2. 發(fā)光法支原體檢測試劑盒(低靈敏度儀器用)檢測數(shù)據(jù)分析。實際讀數(shù)和比值會因細胞種類、細胞培養(yǎng)液、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。