抗氟離子酸性磷酸酶檢測(cè)試劑盒(Fluoride Resistant Acid Phosphatase Assay Kit)是一種用于快速、便捷地檢測(cè)細(xì)胞或組織樣品的裂解或勻漿產(chǎn)物的上清液、血漿、血清、尿液等樣品中內(nèi)源性的抗氟離子酸性磷酸酯酶活性的試劑盒。
酸性磷酸酶(Acid Phosphatase)，也稱酸性磷酸酯酶，在酸性條件下可以催化磷酸酯鍵的水解。酸性磷酸酶是一個(gè)蛋白家
族，哺乳動(dòng)物中其分子量從18kD到100kD不等。酸性磷酸酶主要分為兩類，一類為抗酒石酸酸性磷酸酶(tartrate resistant acid phosphatase, TRAP)，一類為抗氟離子酸性磷酸酶(fluoride resistant acid phosphatase, FRAP)。
抗氟離子酸性磷酸酶包括在絕大多數(shù)細(xì)胞的溶酶體中表達(dá)的溶酶體酸性磷酸酶、前列腺(prostate gland)、腦、肝臟、脾臟和血小板中表達(dá)的酸性磷酸酶�？狗x子酸性磷酸酶在前列腺中的表達(dá)水平非常高，當(dāng)前列腺發(fā)生癌變并出現(xiàn)轉(zhuǎn)移時(shí)抗氟離子的前列腺特異性酸性磷酸酶(prostatic acid phosphatase)活性水平最高。當(dāng)前列腺發(fā)生病變時(shí)會(huì)導(dǎo)致血液中抗氟離子酸性磷酸酶活性顯著升高。同時(shí)，血液中檢測(cè)到抗氟離子酸性磷酸酶活性升高時(shí)，通常是前列腺發(fā)生病變。因此，血清或血漿中抗氟離子酸性磷酸酶活性水平的升高，常被用作前列腺癌等前列腺病變的指標(biāo)。溶酶體儲(chǔ)存性疾病(lysosomal storage diseases)如Gaucher's
disease等，也會(huì)導(dǎo)致血液中抗氟離子酸性磷酸酶活性水平一定程度的升高。
本試劑盒可以檢測(cè)血漿、血清、尿液、細(xì)胞或組織樣品的裂解或勻漿產(chǎn)物的上清液或純化的酶樣品等中的抗氟離子酸性磷酸酶活性。
Para-nitrophenyl phosphate (pNPP)是一種常用的磷酸酶顯色底物，在酸性條件下，可在酸性磷酸酶作用下生成
para-nitrophenol。para-nitrophenol (p-nitrophenol)在堿性條件下，呈黃色產(chǎn)物，可以在400-415nm檢測(cè)吸光度。產(chǎn)物黃色越深，說(shuō)明酸性磷酸酶檢活性越高，反之則酶活性越低。據(jù)此通過(guò)比色分析就可以計(jì)算出酸性磷酸酶活性水平。在適量的氟離子存在的情況下進(jìn)行酸性磷酸酶的活性檢測(cè)，檢測(cè)得到的酸性磷酸酶活性就是抗氟離子酸性磷酸酶活性。
包括標(biāo)準(zhǔn)品和空白對(duì)照，本試劑盒共可進(jìn)行120個(gè)樣品的檢測(cè)。
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| P0335-1 | 檢測(cè)緩沖液 | 15ml |
| P0335-2 | 顯色底物 | 2管 |
| P0335-3 | 氟離子溶液 | 1ml |
| P0335-4 | p-nitrophenol溶液(10mM) | 0.1ml |
| P0335-5 | 反應(yīng)終止液 | 20ml |
| — | 說(shuō)明書(shū) | 1份 |
保存條件：
-20℃保存，一年有效。顯色底物和p-nitrophenol溶液需避光保存。
注意事項(xiàng)：
如果希望進(jìn)行酶活性的絕對(duì)定量，進(jìn)行酶反應(yīng)時(shí)必須注意精確計(jì)時(shí)。此時(shí)推薦采用孵育30分鐘等較長(zhǎng)的時(shí)間，以減小操作過(guò)程中的時(shí)間誤差。同時(shí)如果樣品中酶活性較高，則可以預(yù)先適當(dāng)稀釋樣品。
樣品溶液中須避免出現(xiàn)各種酸性磷酸酶抑制劑。
一管顯色底物配制后需當(dāng)日使用完畢，因此請(qǐng)注意適當(dāng)多準(zhǔn)備一些樣品一起檢測(cè)，以避免試劑盒浪費(fèi)。
氟離子溶液和p-nitrophenol溶液對(duì)人體有害，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或吸入體內(nèi)。反應(yīng)終止液有腐蝕性，操作時(shí)請(qǐng)小心，并注意有效防護(hù)以避免直接接觸人體或腐蝕其他物品。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1. 試劑準(zhǔn)備：將所有試劑取出，恢復(fù)至室溫使用。
a. 顯色底物溶液：取一管顯色底物，溶解于2.5ml的檢測(cè)緩沖液中，充分溶解和混勻，冰上放置。新鮮配制的顯色底物溶液需在6小時(shí)內(nèi)使用。
b. 標(biāo)準(zhǔn)品工作液：取10μl p-nitrophenol溶液(10mM)，用檢測(cè)緩沖液稀釋至0.2ml，最終濃度為0.5mM。
2. 樣品準(zhǔn)備：
a. 細(xì)胞或組織裂解液的準(zhǔn)備：采用適當(dāng)細(xì)胞或組織裂解液裂解細(xì)胞或組織，建議使用P0013J Western及IP細(xì)胞裂解液(無(wú)抑制劑)裂解相關(guān)樣品。如果有必要需進(jìn)行適當(dāng)勻漿，隨后離心取上清，用于抗氟離子酸性磷酸酶的檢測(cè)。注意：裂解液中不能含有磷酸酶抑制劑。樣品可以-80℃凍存，但需避免反復(fù)凍融。
b. 血漿、血清和尿液的準(zhǔn)備：血漿和血清按照常規(guī)方法制備后可以直接用于本試劑盒的測(cè)定，但為了消除樣品本身顏色的干擾，需設(shè)置加了血漿或血清但不加底物的對(duì)照。尿液通常也可以直接用于測(cè)定。上述樣品可以-80℃凍存，但需避免反復(fù)凍融。
c. 樣品的稀釋：如果樣品中含有較高活性的抗氟離子酸性磷酸酯酶，可以使用原有的裂解液或PBS等進(jìn)行稀釋，也可以采用試劑盒中的檢測(cè)緩沖液進(jìn)行稀釋。如果使用試劑盒中提供的檢測(cè)緩沖液進(jìn)行稀釋，需注意保留足夠的檢測(cè)緩沖液用于試劑盒的檢測(cè)過(guò)程。
3. 參考下表使用96孔板設(shè)置空白對(duì)照孔、標(biāo)準(zhǔn)品孔和樣品孔。標(biāo)準(zhǔn)品的用量分別為4、8、16、24、32和40微升，樣品通�？梢灾苯蛹�40微升。如果樣品中的抗氟離子酸性磷酸酯酶活性過(guò)高，可以減少樣品用量或適當(dāng)稀釋后再進(jìn)行測(cè)定。樣品的檢測(cè)最好能設(shè)置平行孔或三復(fù)孔。
| 空白對(duì)照(Blank) | 標(biāo)準(zhǔn)品(Standard) | 樣品(Sample) | |
| 檢測(cè)緩沖液 | 40μl | (80-x)μl | (40-y)μl |
| 顯色底物 | 40μl | － | 40μl |
| 氟離子溶液 | 5μl | 5μl | 5μl |
| 樣品 | － | － | yμl |
| 標(biāo)準(zhǔn)品工作液 | － | xμl | － |
4. 用槍頭輕輕吹打混勻，也可借助搖床進(jìn)行混勻。
5. 37℃孵育5-10分鐘。(說(shuō)明：待測(cè)樣品中抗氟離子酸性磷酸酶活性較低時(shí)，可適當(dāng)延長(zhǎng)孵育時(shí)間至30分鐘)
6. 每孔加入160μl反應(yīng)終止液終止反應(yīng)。此時(shí)，標(biāo)準(zhǔn)品或有抗氟離子酸性磷酸酶活性的孔會(huì)呈現(xiàn)不同深淺的黃色。
7. 在405nm測(cè)定吸光度。如果不能測(cè)定405nm，也可以在400-415nm范圍內(nèi)檢測(cè)吸光度。如果不能立即測(cè)定，可以在數(shù)小時(shí)內(nèi)完成測(cè)定，所顯現(xiàn)的黃色在數(shù)小時(shí)內(nèi)穩(wěn)定。
8. 酸性磷酸酶活性單位的定義：在pH4.8，37℃條件下，每分鐘水解para-nitrophenyl phosphate顯色底物產(chǎn)生1微摩爾
p-nitrophenol所需的酸性磷酸酶的量定義為一個(gè)酶活力單位。
9. 根據(jù)酶活性定義，計(jì)算出樣品中的抗氟離子酸性磷酸酯酶活性。
