總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒
(NBT核黃素比色法)
一、產品簡介：
超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰 離子發(fā)生岐化作用， 生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內一種重要的抗氧化酶； 由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基， 壽命極短，SOD 活性一般用間接方法測定，并利用各種呈色反應來測定 SOD 活力，其中顯色劑有 NBT(唑藍四氮)、WST-1、WST-8 等。
雅吉生物總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT 核黃素比色法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于 NBT 的光還原反應，所以又稱作 NBT 光還原 法， 檢測原理是在有氧化物質存在下核黃素被光還原， 在有氧條件下， 被還原的核黃素極易 再氧化產生超氧陰離子自由基(O2.-) ，O2.-可將氮藍四唑還原為藍色的甲腙，后者在560nm處有強吸收，而 SOD 可清除超氧陰離子(O2.-)，從而抑制了甲腙的形成。于是光還原反應后， 反應液藍色愈深，說明SOD活性愈低， 反之酶活性愈高，據此通過可見分光光度計比色分 析就可以計算出樣品中總超氧化物岐化酶活性水平。本方法是利用SOD抑制NBT在光照下的還原作用來確定酶活性大小，可用于檢測植物、組織、細胞、血清或其它樣品中SOD活性。該試劑盒僅用于科研領域，不適用于臨床診斷或其他用途。。
該試劑盒僅用于科研領域，不適用于臨床診斷或其他用途。
二、產品組成：
| 名稱 | 50T | 100T | Storage |
| 試劑(A): SOD提取液 | 250ml | 2×250ml | RT |
| 試劑(B): Met緩沖液 | 100ml | 2×100ml | 4℃避光 |
| 試劑(C): NBT溶液 | 15ml | 30ml | 4℃避光 |
| 試劑(D): FD溶液 | 15ml | 30ml | 4℃避光 |
三、自備材料：
1、 生理鹽水或 PBS
2、 電子天平、剪刀、低溫冰箱或制冰機、冰袋、勻漿器或研缽、離心機、離心管、小試管、 光照培養(yǎng)箱光源或 40W 熒光燈或日光燈、測光儀(照度計)、分光光度計、比色杯
四、操作步驟(僅供參考)：
1、 準備樣品：
①血漿或含紅細胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應有溶血，如果含有應去除紅細胞后檢測，如超過檢測范圍，用SOD提取液稀釋后檢測。血清去除紅細胞的簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少500μl全血，4℃ 3000g離心5min，轉移上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測；亦可采用紅細胞裂解液去除紅細胞，如 ACK紅細胞裂解液等。
②組織樣品：動物用含有20U/ml Heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 4000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。
③細胞樣品：對于貼壁細胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細胞�？梢允褂眉毎位駿DTA處理細胞并收集細胞，細胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次，按照每106細胞加入300～500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。
④植物樣品：準確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g，剪碎，置于4℃預冷的研缽或勻漿器中，加入預冷提取液1ml，低溫研磨至勻漿后轉移至離心管，用3ml提取液沖洗研缽或勻漿器并轉入離心管，加提取液至總體積為4ml，4℃ 10000r/min離心20min，上清液為酶提取液，上清液可用于SOD的檢測。注意：如果SOD酶活性較低，應相應減少提取液的總體積，以便提高SOD酶的濃度。
⑤上述樣品準備完畢后可以BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，通常10-20μg蛋白的細胞或組織勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個活力單位左右(不同細胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)；每種樣品準備20～100μg蛋白量通常已經足夠用于后續(xù)檢測，根據蛋白濃度和預計的蛋白使用量，用該試劑盒提供的SOD提取液適當稀釋樣品，例如小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10～100倍，準備好的樣品如果當天測定，可以冰浴保存；如果當天不能完成測定，可以-20℃凍存，但建議盡量當天完成測定。
2、 (選做)準備SOD標準品：需自備SOD標準品，用本試劑盒提供的SOD提取試劑將SOD 標準品稀釋至如下系列濃度： 200、100、50、20、10、5、2U/ml，各取20μl參考樣 品進行檢測。
注意：為避免稀釋后SOD酶活性的下降，SOD 標準品宜現稀釋現使用 ，該試劑盒對于 SOD的檢測并不需要SOD作為標準品， 但可使用SOD標準品作為陽性對照或作為對 SOD 活性定量的參考。
3、 選取合適的光源：在光照培養(yǎng)箱或日光燈下， 用光度儀測定光度值為 3500~4000Lx 的
適合光照反應的位置，做出標記。
4、配制NBT工作液：將 Met緩沖液與NBT溶液按 23:3 的比例混合即可。
5、SOD加樣：參考下表使用96孔板設置空白對照孔、光照對照孔、測定孔， 在低光強條件下按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液， 加入 FD 溶液后充分混勻。
注意：加入FD 溶液后反應即會開始，在低光強條件下用排槍操作可減小各孔間因加入試劑的時間先后差異而導致的誤差。
| 加入物(ml) | 空白對照孔 | 光照對照孔 | 測定孔 |
| SOD 提取試劑 | 0.08 | 0.08 |
|
| 待測樣品(上清液) | — | — | 0.08 |
| NBT 工作液 | 2.08 | 2.08 | 2.08 |
| FD 溶液 | 0.24 | 0.24 | 0.24 |
6、 SOD 測定：混勻，取空白對照孔置于暗處， 其他各孔置于 4000Lx 日光下反應 20min， 各孔受光情況應一致， 溫度高時時間可縮短， 低時延長； 反應結束后，以不照光的空白對照孔調零，用酶標儀測定 560nm 處吸光度。
五、計算結果：
SOD活力單位定義：以抑制NBT光化還原的50%為一個酶活性單位(U)。
液體中總SOD活力(U/ml)=(A光照－A測定)/(50%×A光照×VT)
組織、細胞勻漿液中總SOD活力(U/g)=(A光照－A測定)×V/(50%×A光照×VT×W)
血液中總SOD活力(U/gHb)=(A光照－A測定)×V×C/(50%×A光照×VT×Hb)
式中：A光照=光照對照管的吸光度
A測定=測定管的吸光度
V=樣品液總體積(ml)
VT=測定時樣品所用體積(ml)
W=樣品鮮質量(g)
C=1ml/采血量(ml)
Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)
六、注意事項:
1、 上述低溫試劑避免反復凍融，以免失效或效率下降。待測樣品-70℃可保存 1 個月，需 注意反復凍融會導致 SOD 部分失活。
2、 植物中的多酚類物質會引起酶蛋白不可逆沉淀，使酶失去活性，因此在提取 SOD 酶時， 必須添加多酚類物質的吸附劑， 將多酚物質除去， 避免酶蛋白變性失活。SOD 提取試 劑含有 PVP 等成分， 可有效去除多酚類物質。 SOD 提取試劑不夠用可以用磷酸鈉緩沖
液(0.05M,pH7.8)替代。
3、 細胞或組織等樣品制備時，不能采用含有 Triton X-100 等去垢劑的溶液，否則會干擾 本試劑盒的檢測。
4、 抗氧化物會對本試劑盒的檢測產生干擾，例如 0.1mM ascorbic acid ，5mM GSH 都 會使測定出來的吸光度顯著升高。
5、 對于植物樣品， 研磨處理應迅速，以免 SOD 酶活下降，盡量在冰浴條件下處理。
6、 如果用酶標儀， 96 孔板每孔加入的各試劑量應相應按比例減少，相應檢測的次數大大 增加。
7、 所用離心管或 96 孔板應潔凈透明， 透光性好。
8、 一般要求各孔受光情況一致，所有反應管應排列在與日光燈燈管平行的直線上。
9、 反應溫度控制在 25℃,視酶活性高低適當調整反應時間； 溫度較高時， 光照時間應縮 短；溫度較低時，光照時間相應延長。
10、 如果無 4000Lx 日光， 可 200W 在 10~12cm 處 ，照射 20min；超凈工作臺 5cm 處 光強約 800~1000Lx ，,照射 30~40min；強太陽光下一般光強可達 30000Lx ，照射 5~15min ，一般不建議直接用太陽光。
11、 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
七、有效期∶6個月有效。
