正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定
測定意義:
淀粉是植物中糖的主要儲存形式,其含量測定對于評價食品營養(yǎng)價值和調(diào)查植物體內(nèi)糖代謝都有重要意義。
測定原理:
利用 80%乙醇可以把樣品中可溶性糖與淀粉分開,進一步采用酸水解法分解淀粉為葡萄糖,采用蒽酮比色法測定葡萄糖含量,即可計算淀粉含量。
需自備的儀器和用品:
可見分光光度計/酶標(biāo)儀、水浴鍋、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰、濃硫酸(不允許快遞)、研缽和蒸餾水。
試劑的組成和配制:
試劑一:液體 100mL×1 瓶,4℃保存; 試劑二:液體 35mL×1 瓶,4℃保存; 試劑三:粉劑×1 瓶,4℃保存;
淀粉提取:
1、稱取0.1~0.2g 樣本(建議稱取約 0.1g 樣本)于研缽中研碎,加入1mL 試劑一,充分勻漿后轉(zhuǎn)移到 EP 管中,80℃水浴提取 30min,3000g,25℃離心 5min,棄上清,留沉淀。
2、沉淀中加入0.5mL 蒸餾水,放入95℃水浴中糊化 15min(蓋緊,以防止水分散失)。
3、冷卻后,加入 0.35mL 試劑二,25℃常溫提取 15min,振蕩 3-5 次。
4、加入 0.85mL 蒸餾水,混勻,3000g,25℃離心 10min,取上清液待測。
測定步驟:
1、分光光度計或酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上,調(diào)節(jié)波長至 620nm,蒸餾水調(diào)零。
2、調(diào)節(jié)水浴鍋至 95 度。
3、工作液的配制:臨用前在試劑三中加入 3.75mL 蒸餾水后,緩慢加入 21.25mL 濃硫酸,不斷攪拌,充分溶解,待用;用不完的試劑 4℃保存一周;
4、樣本測定:取50μL 樣本和250μL 工作液至EP 管中,95 度水浴10 min(蓋緊,防止水分散失),自然冷卻至室溫,取200uL 至微量石英比色皿或96 孔板中,在620 nm 波長下記錄測定吸光度值A。
淀粉含量計算:
a. 用微量石英比色皿測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y =5.872x-0.0295;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y 為吸光值。
1、按照蛋白濃度計算
淀粉含量(mg/mg prot)=[(A+0.0295)×V1]÷5.872 ÷(V1×Cpr)=0.17×(A+0.0295) ÷Cpr
2、按樣本鮮重計算
淀粉含量(mg/g 鮮重)= [(A+0.0295)×V1] ÷5.872÷(W×V1÷V2) =0.289×(A+0.0295) ÷W
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.025mL;V2:加入提取液體積,1.7 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g
b.用 96 孔板測定的計算公式如下
標(biāo)準(zhǔn)條件下測定的回歸方程為y=2.936x-0.0295;x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/mL),y 為吸光值。
1、按照蛋白濃度計算
淀粉含量(mg/mg prot)=[(A+0.0295)×V1]÷2.936 ÷(V1×Cpr)=0.34×(A+0.0295) ÷Cpr
2、按樣本鮮重計算
淀粉含量(mg/g 鮮重)=[(A+0.0295)×V1]÷2.936÷(W×V1÷V2) =0.578×(A+0.0295) ÷W
V1:加入反應(yīng)體系中樣本體積,0.025mL;V2:加入提取液體積,1.7 mL;Cpr:樣本蛋白質(zhì)濃度,mg/mL;W:樣本質(zhì)量,g
注意 :由于工作液具有強腐蝕性,請謹(jǐn)慎操作。
若吸光值大于1,請將樣本用提取液稀釋后再測定,計算公式中乘以相應(yīng)的稀釋倍數(shù)。提取液的配置:0.35mL 試劑二+1.35mL 水。用多少按照此比例配多少。
最低檢測限為 10μg/g 鮮重或 100ng/mgprot 。