注    意：正式測(cè)定前務(wù)必取2-3個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定

測(cè)定意義：

輔酶ⅡNADP(H)廣泛存在于動(dòng)物、植物、微生物和培養(yǎng)細(xì)胞中，NADP+和NADPH含量測(cè)定可以計(jì)算NADP（NADPH + NADP+ )含量和NADPH/NADP+比值，其變化與磷酸戊糖途徑和生物合成以及抗氧化反應(yīng)密切相關(guān)。NADPH/NADP+比值不僅是細(xì)胞氧化還原態(tài)的主要標(biāo)志之一，而且在PPP途徑、生物合成和抗氧化代謝中具有重要調(diào)控作用。

測(cè)定原理：

分別用酸性和堿性提取液提取樣品中NADP+和NADPH。NADPH通過PMS的遞氫作用，使氧化型噻唑藍(lán)（MTT）還原為甲瓚，570nm下檢測(cè)吸光值，從而測(cè)定NADPH含量。利用6-磷酸葡萄糖脫氫酶還原NADP+為NADPH，從而檢測(cè)NADP+含量。

所需的儀器和用品：

可見分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、可調(diào)式移液器、1 mL玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

試劑的組成和配制：

酸性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；

堿性提取液：50mL×1瓶，4℃保存；

試劑一：液體15 mL×1瓶，4℃保存；

試劑二：粉劑×1支，-20 ℃保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻；用不完的試劑4℃保存一周；

試劑三：粉劑×1支，-20℃保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻；用不完的試劑4℃保存一周；

試劑四：粉劑×1支，4 ℃保存，用時(shí)加入4mL蒸餾水，混勻；用不完的試劑4℃保存一周；

試劑五：液體1.8mL×1支，4 ℃保存；

試劑六：液體30mL×1瓶，4 ℃保存；

試劑七：液體50mL×1瓶，4 ℃保存。

NADP+和NADPH的提�。�

1 血清（漿）中NADP+和NADPH的提取

NADP+的提�。喊凑昭�清（漿）體積（mL）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL酸性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADPH的提�。喊凑昭�清（漿）體積（mL）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1mL血清（漿），加入1mL堿性提取液），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2組織中NADP+和NADPH的提�。�

NADP+的提取：按照組織質(zhì)量（g）：酸性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADPH的提�。喊凑战M織質(zhì)量（g）：堿性提取液體積（mL）為1：5~10的比例（建議取約0.1g組織，加入1mL堿性提取液），冰浴研磨，95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

3 細(xì)胞或細(xì)菌中NADP+和NADPH的提�。�

NADP+的提�。合仁占�細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：酸性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL酸性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL堿性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

NADPH的提�。合仁占�細(xì)胞或細(xì)菌到離心管內(nèi)，棄上清，按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（104個(gè)）：堿性提取液體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細(xì)菌或細(xì)胞加入1mL堿性提取液），超聲波破碎（冰浴，功率20％或200W，超聲3s，間隔10s，重復(fù)30次），95℃水浴5min（蓋緊，以防止水分散失）；冰浴中冷卻后，10000g 4 ℃離心10min；取500μL上清液，加入500μL酸性提取液使之中和，混勻，10000g 4 ℃離心10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱30min以上，調(diào)節(jié)波長至570nm，蒸餾水調(diào)零。

2、加樣表(在1.5mL棕色EP管中按下表依次加樣）：

試劑名稱(μL)對(duì)照管測(cè)定管

樣本5050

試劑一250250

試劑二7575

試劑三7575

試劑四7575

試劑五3535

試劑六500混勻，室溫避光靜置20min

試劑六500

充分混勻，靜置5min后，20000g，25℃離心5min，棄上清，沉淀中加入：

試劑七10001000

混勻，570nm下比色，讀取對(duì)照吸光值A1和測(cè)定管吸光值A2，計(jì)算△A=A2-A1。