介紹： 基 因 型E.coli B e14-(McrA-) Δ(mcrCB-hsdSMR-mrr)171 endA1 gyrA96 thi-1 supE44 relA1 lac recB recJ sbcC umuC::Tn5 (Kanr) uvrC [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)].
簡(jiǎn) 要 說 明真核生物DNA存在較多“十字型”、“Z字型”等二級(jí)或三級(jí)結(jié)構(gòu)，這種DNA結(jié)構(gòu)在利用傳統(tǒng)大腸桿菌進(jìn)行克隆時(shí)易被大腸桿菌體內(nèi)的重組酶系統(tǒng)或其他防御系統(tǒng)識(shí)別并對(duì)其進(jìn)行重組，刪除等破壞，導(dǎo)致很難對(duì)這類DNA進(jìn)行正確的克隆操作。SURE菌株可以解決這些問題：此菌株體內(nèi)重組酶系統(tǒng)整條通路被破壞，并且(McrA-, McrCB-, McrF-, Mrr-, HsdR-) 這些限制性突變的存在賦予此菌株無法對(duì)外源DNA進(jìn)行標(biāo)記、限制的能力，提高了外源甲基化DNA的克隆效率，同時(shí)具有核酸酶(endA)突變、重組酶 (recB recJ)突變，增強(qiáng)了外源DNA的穩(wěn)定性。存在于F´因子上的lacIqZΔM15基因使此菌株可以進(jìn)行藍(lán)白斑篩選；Kanr，Tetr賦予菌株卡那霉素和四環(huán)素抗性。High5TM系列SURE感受態(tài)細(xì)胞由特殊工藝制作，經(jīng)pUC19質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率達(dá)5×108cfu/μg。
操 作 說 明
1.SURE感受態(tài)細(xì)胞放置冰中融化（或放手心或室溫片刻，待菌體處于冰水混合狀態(tài)時(shí)迅速插入冰中），加入目的DNA（質(zhì)�；蜻B接產(chǎn)物）并用手撥打EP管底輕輕混勻，冰上靜置25分鐘。2.42℃水浴熱激45秒，迅速放回冰上并靜置2分鐘，晃動(dòng)會(huì)降低轉(zhuǎn)化效率。
3.向離心管中加入700μl不含抗生素的無菌培養(yǎng)基（2YT或LB），混勻后37℃，200rpm復(fù)蘇60分鐘。4.5000rpm離心一分鐘收菌，留取100μl左右上清輕輕吹打重懸菌塊并涂布到含相應(yīng)抗生素的2YT或LB培養(yǎng)基上。5.將平板倒置放于37℃培養(yǎng)箱過夜培養(yǎng)。注 意 事 項(xiàng)1.感受態(tài)細(xì)胞最好在冰上融化。2.混入質(zhì)粒或連接產(chǎn)物時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3.操作過程中勿將感受態(tài)暴露于氧化性環(huán)境中，例如超凈臺(tái)應(yīng)將臭氧排凈后再使用。
4.轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)�；蚋咝实倪B接產(chǎn)物可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
5.此菌株具有卡那霉素，四環(huán)素抗性，擁有這兩種抗性的質(zhì)粒無法使用；對(duì)<40 µg/ml氯霉素有抗性，但對(duì)100 µg/ml氯霉素敏感。使用其他抗生素參考濃度：氨芐青霉素（終濃度： 100 µg/ml），氯霉素（終濃度：100 µg/ml）。
6.High5TM系列SURE感受態(tài)細(xì)胞采用常規(guī)轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化效率可達(dá)5×108cfu/μg。 ；如果有更高要求，可嘗試Stratagene公司推薦的標(biāo)準(zhǔn)protocol。Stratagene standard protocol1.Pre-chill a 14-ml BD Falcon polypropylene round-bottom tubes on ice. Preheat NZY+ broth to 42℃.2.Thaw the cells on ice. When thawed, gently mix and aliquot 100 µl of cells into the pre-chilled tubes.3.Add 4 µl of the β-ME(β巰基乙醇) to the aliquot of cells.4.Swirl the tubes gently. Incubate the cells on ice for 10 minutes, swirling gently every 2 minutes.5.Add 0.1-50 ng of the experimental DNA (or 2 µl of a ligation mixture) to the aliquot of cells.6.Swirl the tubes gently, then incubate the tubes on ice for 30 minutes.7.Heat-pulse the tubes in a 42℃ water bath for 30 seconds. The duration of the heat pulse is critical.8.Incubate the tubes on ice for 2 minutes.9.Add 0.9 ml of preheated (42℃) NZY+ broth and incubate the tubes at 37℃ for 1 hour with shaking at 225-250 rpm.10.Plate ≤200 µl of the transformation mixture on LB agar plates containing the appropriate antibiotic (and containing IPTG and X-gal if color screening is desired).11.Incubate the plates at 37℃ overnight. If performing blue-white color screening, incubate the plates at 37℃ for at least 17 hours to allow color development (color can be enhanced by subsequent incubation of the plates for 2 hours at 4℃).
