1. 含可見光和熒光染料，既可以用金屬浴和水浴擴(kuò)增用可見光肉眼判斷結(jié)果，也可用熒光 PCR 儀進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)。
2. 內(nèi)含的 dUTP-UNG 可防交叉污染。
3. 特異性比 RT-PCR 高，因?yàn)?/font> RT-LAMP 擴(kuò)增使用 4-6 條引物而不是兩條。
4. 靈敏性可達(dá) 10 拷貝/反應(yīng)以下（隨引物而不同），故假陰性率更低。
只可用于科研，只可進(jìn)行定性檢測(cè)，不能用于定量檢測(cè)。
| 成份 | 編號(hào) | 塑料盒包裝 |
| MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），200U/μL | 60905a | 50 μL（黃蓋） |
| 4×RT Buffer（含 dNTP） | 60905b | 250 μL（白蓋） |
| 5×熒光及可視化LAMP MagicMix | 200603a | 200 μL（綠蓋） |
| Bst DNA 聚合酶 2.0（8U/uL） | 200403 | 50 uL (紅蓋) |
| RT-LAMP 陽(yáng)性對(duì)照模板-引物混合物 | 130923a | 20 μL（黃蓋） |
| 超純水 | 100935 | 1mL（亮黃蓋） |
| 使用手冊(cè) | 200603sc | 1 份 |
低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為一年
RT-LAMP 模板及 RT-LAMP 引物、PCR 級(jí)石蠟油（僅對(duì)使用金屬浴或水浴者）。
準(zhǔn)備工作：如果使用水浴鍋或金屬浴，需要在實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)前打開并調(diào)到 60-65℃。如果用金屬浴，還必須在孔中加水以填充金屬孔和反應(yīng)管間的空隙。金屬浴和水浴溫控遠(yuǎn)遠(yuǎn)不如PCR 儀器，所以使用前需要用陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照（水）做預(yù)實(shí)驗(yàn)確認(rèn)可用。一、樣品 RNA 的制備
1. 用自選方法純化樣品的 RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù) RNA 提取試劑盒兼容。
2. 如果有 N 個(gè)樣品，則至少需要做 N+2 個(gè)樣品制備，包括一個(gè)制備陽(yáng)性對(duì)照（制備時(shí)加入自備的跟要檢測(cè)的靶分子相同的陽(yáng)性對(duì)照模板，一起經(jīng)歷提取過程）和一個(gè)制備陰性對(duì)照（用水替代樣品）。最后 N+2 個(gè)樣品一起進(jìn)行 RNA 提取操作，得到 N+2 個(gè) RNA 樣品。
二、合成 1st-strand cDNA
按下表配制 RT 反應(yīng)體系:
| 成分 | 加入量 |
| 自備 RNA 模板總 RNA 或 poly(A) mRNA 或?qū)Ｒ坏?RNA 注意：RNA 樣品不能有基因組 DNA 污染。 |
100-500 ng 10-500 ng 0.01pg-500ng |
| 自備引物 F3 | 1 μL |
| 4×RT Buffer（含 dNTP） | 5 μL |
| 自備 RNase-free 水 | 補(bǔ)水到 19 μL |
4. 70℃保溫 5 分鐘后立即冰浴。
5. 37℃保溫 5 分鐘。對(duì)富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的高 GC RNA 模板，可改成 45℃保溫 5 分鐘。
6. 加入 1μL (=200 U) MMLV 逆轉(zhuǎn)錄酶（含 RI），終體積為 20μL。
7. 42℃保溫 60 分鐘。
8. 70℃保溫 10 分鐘以終止反應(yīng)，放置在冰上待用。合成的 cDNA 可以直接作為
LAMP 模板使用，不需要純化。
三、 熒光及可視化 LAMP 擴(kuò)增及檢測(cè)（20μL 體系）
9. 反應(yīng)設(shè)置：如果有 N+2 個(gè) cDNA 樣品，則最好設(shè)置 N+4 個(gè)LAMP 擴(kuò)增，增加 LAMP
陰性對(duì)照和 LAMP 陽(yáng)性對(duì)照各 1 個(gè)。在 N+4 個(gè) 0.2mL PCR 管中加入下列成分：
10. 混勻后進(jìn)行擴(kuò)增。由于本產(chǎn)品含雙染料，可以根據(jù)實(shí)驗(yàn)室條件選擇下列三種方式進(jìn)行擴(kuò)增和檢測(cè)。
11. 如果使用PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼檢測(cè)，則必須先在每個(gè)反應(yīng)管中加 30 μL 自備的石蠟油，否則保溫期間反應(yīng)體系的水分會(huì)蒸發(fā)，影響反應(yīng)效率（如果使用 PCR 儀器并開啟熱蓋，則可以不加石蠟油）。60-65℃保溫 90 分鐘，肉眼觀察管內(nèi)液體顏色。
12。如果使用熒光定量 PCR 儀：設(shè)為 60-65℃保溫 1 分鐘/循環(huán)， 90 個(gè)循環(huán)，每分
鐘在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào)。
13. 如果使用PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，再使用 qPCR 儀進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù)： 則在擴(kuò)增前和擴(kuò)增后，分別在 qPCR 儀器上測(cè)熒光讀數(shù)（溫度設(shè)為 60-65℃，1 次循環(huán)，每次循環(huán) 1 分鐘，在 FAM 通道采集一次熒光信號(hào)。注意：測(cè)熒光讀數(shù)必須在 65℃進(jìn)行）。擴(kuò)增反應(yīng)按 60-65℃，90 分鐘進(jìn)行。
四、 結(jié)果分析及解讀
14. 如果是用普通PCR 儀器、水浴或金屬浴進(jìn)行的擴(kuò)增，反應(yīng)結(jié)束后只能肉眼判斷結(jié)果。將反應(yīng)管放置在白色背景（如白紙）前觀察。擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液將呈現(xiàn)藍(lán)色，無模板和無引物的陰性對(duì)照將呈淺藍(lán)色。如果擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管內(nèi)反應(yīng)液不呈現(xiàn)藍(lán)色，或無模板和無引物的陰性對(duì)照任何一個(gè)呈現(xiàn)藍(lán)色，則說明試劑有問題，實(shí)驗(yàn)無效。請(qǐng)跟廠家聯(lián)系。
15. 如果實(shí)驗(yàn)有效，則分析 N+2 個(gè)樣品管的結(jié)果。如果樣品管反應(yīng)液的顏色接近擴(kuò)增陽(yáng)性對(duì)照管則說明有擴(kuò)增，如果接近無模板和無引物的陰性對(duì)照，則說明無擴(kuò)增。反應(yīng)結(jié)果示例見左圖（9 為陰性，10 為陽(yáng)性）。
16. 如果是用熒光PCR 儀進(jìn)行擴(kuò)增，則可分析擴(kuò)增曲線和 Ct。試劑盒提供的陽(yáng)性對(duì)照的 Ct 將小于 60，如果大于 60，說明試劑可能失效，需跟廠家聯(lián)系。無模板陰性對(duì)照和無引物陰性對(duì)照的 Ct 將大于 90。如果任何小于 90，則說明試劑或環(huán)境被污染，需重復(fù)實(shí)驗(yàn)或跟廠家聯(lián)系。如果陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照 Ct 都在正常范圍，則分析樣品的 Ct。Ct 小于 60 的判斷為陽(yáng)性，大于 90 判為陰性，在 60-90 之間則需要重復(fù)檢測(cè)。
17. 如果使用 PCR 儀、金屬浴或水浴進(jìn)行擴(kuò)增，肉眼檢測(cè)，再使用熒光定量 PCR 儀進(jìn)行終點(diǎn)法熒光讀數(shù)來判斷陰陽(yáng)性，則先比較陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。陽(yáng)性對(duì)照樣品擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該超過 100%，陰性對(duì)照擴(kuò)增后信號(hào)增幅應(yīng)該低于 50%，否則實(shí)驗(yàn)無效，請(qǐng)與廠家聯(lián)系。如果兩個(gè)對(duì)照均有效，則比較樣品擴(kuò)增前后熒光讀數(shù)的差值。如果擴(kuò)增后熒光信號(hào)增幅低于 50%，則判斷為陰性。如果熒光信號(hào)增幅高于 100%，則判斷為陽(yáng)性。熒光信號(hào)增幅在 50-100%之間的，則需要重測(cè)。
18. 當(dāng)實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)和可視化檢測(cè)同時(shí)用于判讀結(jié)果時(shí)，如果彼此不一致，以實(shí)時(shí)熒光LAMP 的數(shù)據(jù)為準(zhǔn)。一般可視化結(jié)果滯后實(shí)時(shí)熒光檢測(cè)結(jié)果 20-30 分鐘，也就是說，在 qPCR 儀上第 30 分鐘時(shí)呈現(xiàn)陽(yáng)性的樣品，其反應(yīng)液的顏色變化一般在第
50-60 分鐘時(shí)才能觀察到。
