Epstein Barr 病毒染料法熒光定量 PCR 試劑盒 EB 病毒（Epstein-Barr Virus，EBV，EB 病毒）是皰疹病毒科嗜淋巴細(xì)胞病毒屬的成員，基因組為 DNA。EB 病毒具有在體內(nèi)外專一性地感染人類及某些靈長類B 細(xì)胞的生物學(xué)特性。人是 EB 病毒感染的宿主，主要通過唾液傳播。無癥狀感染多發(fā)生在幼兒，3～5 歲幼兒 90%以上曾感染 EB 病毒，90%以上的成人都有病毒抗體。 EB 病毒是傳染性單核細(xì)胞增多癥的病原體，此外 EB 病毒與鼻咽癌、兒童淋巴瘤的發(fā)生有密切相關(guān)性，被列為可能致癌的人類腫瘤病毒之一。本公司開發(fā) EBV 染料法熒光定量 PCR 試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2. 引物根據(jù) EB 病毒專一區(qū)設(shè)計，特異性高。
3. 熒光定量PCR 檢測，比常規(guī) PCR 更加靈敏。
4. 一管式閉管操作，降低了交叉污染。
5. 本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
| 成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
| 2×qPCR Magic Mix | 90408 | 500 μL（棕色管） |
| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
| EB 病毒染料法 qPCR 引物混合液 | 14-60800yw | 100 μL（白蓋） |
| EB 病毒染料法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 60908-60800pc | 50 μL（黃蓋） |
| 使用手冊 | 14-60800sc | 1 份 |
低溫運輸、-20℃保存，有效期一年
一、稀釋 PCR 陽性對照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于陽性對照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽性對照。
2. 標(biāo)記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
6. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照到 5 號管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽性對照。放冰上待用。
7. 重復(fù)上面的操作直到得到 6 個稀釋度的陽性對照。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
8. 如果有 N 個樣品，必須設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），
一個是 NC（樣品制備陰性對照）。可以用 10μL PCR 陽性對照的 10000 倍稀釋的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽性對照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）。可以用水作為制備的陰性對照。制備所得成為樣品 DNA。
9. 用自選方法純化 N+2 個樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進行）
10. 如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照，6 個用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品，1 個用于PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于PCR 陽性對照（用第 4 號陽性對照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟， 定性分析只是把 6 個標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個，其余不變。
11. 在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢
后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）
| 成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | PCR 陽性 對照管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| EB病毒染料法qPCR 引物混 合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自備 10×ROX (見注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 待測樣品 cDNA 模板 | 6 μL | - | - |
| 自備超純水 | - | 6 | - |
| 第 7 步所得 PCR 陽性對照稀釋液（2-7 號） |
- |
- | 各 6μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
四、數(shù)據(jù)處理
12. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
13. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 36。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 34 則為陰性，如果小于或等于 30 則為陽性。如果在 30-34 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 34，擴增曲線有
明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性
