產(chǎn)品及特點
支原體和親緣關(guān)系很近的無膽甾原體、螺旋體統(tǒng)稱霉形體。霉形體是目前發(fā)現(xiàn)的最小的、最簡單的原核生物。它們?nèi)狈毎凇⒂凶冃文芰�、能通過濾菌器、 可在無生命培養(yǎng)基中生長繁殖，成為細胞培養(yǎng)中常見的一種污染源，嚴重影響細胞生長率、細胞形態(tài)、基因表達、細胞代謝和細胞活力。因此快速靈敏檢測支原體具有重要意義。本產(chǎn)品就是為此目的根據(jù) PCR 原理開發(fā)的試劑盒，它具有下列特點：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3.提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)支原體高度保守區(qū)設(shè)計，不會跟其他微生物的 DNA 發(fā)生交叉反應。
5.本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應。
6.本產(chǎn)品只能用于科研。
| 成份 | 編號 | 十孔盒包裝 |
| PCR MagicMix 3.0 | 90805 | 1 mL（紅蓋） |
| 超純水 | 100935 | 1 mL（亮黃蓋） |
| 支原體通用 PCR 引物混合液 | 13-74000yw | 100 μL（白蓋） |
| 支原體通用 PCR 陽性對照 （1×10E8 拷貝/μL） | 13-74000pc | 50 μL（黃蓋） |
運輸及保存：低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。
自備試劑：樣品 DNA。
使用方法：
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。
由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3.在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用
5.換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用
6.重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）�？梢杂� 10μL 陽性對照的 10000倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。也可以選購本公司的核酸釋放劑，使用后其裂解液可以直接作為 PCR 模板，省略了 DNA 提取步驟。
三、Probe qPCR 反應（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè) 置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好
后最后加）：
| 成分 | N+2 個 樣品管 | PCR 陰性 對照管 | PCR 陽性 對照管 |
| PCR MagicMix 3.0 | 各 20 μL | 20 μL | 20 μL |
| 支原體通用 PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 2 μL |
| N+2 個樣品 DNA 模板 | 各 18 μL | - | - |
| PCR 陰性對照（超純水） | - | 18 μL | - |
| PCR 陽性對照（支原體通用 PCR 陽 性對照的 10000 倍稀釋液） | - | - | 18 μL |
12.蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：
| 過程 | 溫度 | 時間 |
| 預變性 | 95℃ | 5 min |
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PCR 反應 （35 個循環(huán)） | 95℃ | 30 sec |
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| 55℃ | 30 sec |
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| 72℃ | 60 sec |
| 最后延伸 | 72℃ | 10 min |
四、數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 34。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 34 則為陰性，如果小于或等于 30則為陽性。如果在 30-34之間，則重復一次。重復實驗的 Ct值，如果大于或等于 34 則為陰性，如果小于 30，則為陽性。
