1. 即開即用,用戶只需要提供樣品 DNA。
2. 根據(jù)鹿保守區(qū)域設計引物,能專一性地檢測出樣品中的鹿成分,包括馬鹿、梅花鹿、坡鹿、水鹿和白唇鹿,但不能檢測其他動物成分。
3. 熒光定量 PCR 檢測,既可以定量,也可以定性,比常規(guī)PCR 更加靈敏和靈活。
4. 快速,整個檢測過程(按一個樣品計)所需時間僅為 2.0 小時。
5. 一管式閉管操作,降低了交叉污染。
6. 提供陽性標準品,便于分析實驗結(jié)果。
7. 對混合樣品中鹿成分的檢測下限為 0.1%, 對樣品中鹿成分的核酸檢測下限為 1.0ng/µL。
8. 本只能用于科研,足夠 50 次 20μL 體系的熒光定量 PCR。
本產(chǎn)品參考國家標準 GB/T21106-2007 制備
成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
2×qPCR MagicMix | 90408 | 0.5 mL(棕色) |
熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL(黃蓋) |
鹿源性成分染料法PCR 引物混合液 | 14-112yw | 100 μL(白蓋) |
鹿源性成分染料法PCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 14-112pc | 50 μL(黃蓋) |
核酸釋放劑試用裝 | 61202 | 20 次(1mL,綠蓋) |
使用手冊 | 13-510sc | 1 份 |
低溫運輸,-20℃保存,有效期一年。使用本試劑盒提供的陽性對照時,由于其濃度較
高,一定要注意不要污染其他試劑和成分。最好在專門的區(qū)域操作。
一、稀釋標準曲線樣品(以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例)。由于標
準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原,本產(chǎn)品不提供動物樣品做陽性對照,只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。
1. 標記 6 個離心管,分別為 7,6,5,4,3,2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 陽性對照(濃度為 1×10E8 拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭,在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭,在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩 1 分鐘,得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7. 用自選方法純化樣品的 DNA,本產(chǎn)品跟市場上絕大多數(shù)核酸純化產(chǎn)品兼容。
8. 如果有 N 個樣品,則需要進行 N+2 個樣品提取,多出的一個用作樣品制備陽性對照管、另一個用作樣品制備陰性對照管。
三、設置 qPCR 反應(20μL 體系,在樣品制備室進行)
2. 如果做定量分析并且只做 1 次重復,則標記 N+9 個PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品,1 個用于 PCR 陰性對照,6 個用于標準曲線。如果做定性分析,并且只做 1 次重復,則標記 N+4 個PCR 管,其中 N+2 個用于上步得到的N+2 個樣品,1 個用于PCR 陰性對照(用水做模板),1 個用于PCR 陽性對照(用第 4 號陽性對照稀釋液,濃度為 10000 拷貝/μL)。下面只描述定量分析的步驟, 定性分析只是把 6 個標曲反應縮減成 1 個,其余不變。
3. 在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設置完畢
后才設置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)
成分 | 樣品管 N+2 個 | PCR 陰性 對照管 | 標準曲線 樣品管(2-7 管) |
2×qPCR MagicMix | 各 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
鹿源型成分染料法PCR 引物混合液 | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
自備 10×ROX (見注) | 各 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
N+2 個制備的 DNA 模板 | 各 6 μL | 不加 | 不加 |
超純水 | 不加 | 6 μL | 不加 |
第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 (2-7 號) |
不加 |
不加 | 各 6μL(2 號樣到 2 號管,3 號樣到 3 號管…) |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對照,其他熒光 PCR 儀器(如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480)不需要使用 ROX,則用水替代。
蓋上蓋子后上機,按下面參數(shù)進行 qPCR(具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù) qPCR 儀器的不同而自行優(yōu)化)。
五、數(shù)據(jù)處理
11. 如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸,以 Ct 值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 DNA 濃度的log 值,再推算出其濃度。
12. 如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct 值應該小于或等于30。對待測樣品,如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性,如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間,則重復一次。重復實驗的 Ct 值如果大于或等于 40 則
為陰性,如果小于 40,則為陽性。