【用途】本試劑盒采用實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 方法檢測(cè)偶蹄動(dòng)物水泡皮、水泡液及 OP 液中的塞尼卡病毒（SVV）的 RNA，適用于 SVV 的檢測(cè)、診斷和流行病學(xué)調(diào)查。

【原理】提取樣品 RNA，在高效反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點(diǎn)合成與 RNA 模板互補(bǔ)的 cDNA 鏈。在熱啟動(dòng) Taq 酶的作用下， 經(jīng)高溫變性、中溫退火及延伸的循環(huán)，使特異

DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍，經(jīng)熒光素標(biāo)記的探針與擴(kuò)增的 DNA 雜交，利用 Taq 聚合酶的 5'→3' 外切活性，使熒光探針的報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)分離，發(fā)出特異性熒光信號(hào)，利用熒光 PCR 儀檢測(cè)特異性熒光信號(hào)，根據(jù)樣品 Ct 值的大小及擴(kuò)增曲線的形成情況判定結(jié)果。

【試劑盒組成】

【需要自備的器材】

1．試劑：核酸提取試劑。

2．儀器：離心機(jī)、熒光 PCR 擴(kuò)增儀、-20℃冰箱、可調(diào)移液器（2µL、20µL 、200µL、1000µL）。

3．耗材：熒光 PCR 專用反應(yīng)管、吸頭（10µL、

200µL、1000µL）。

【使用注意事項(xiàng)】

1．建議與世紀(jì)元亨提供的柱式 RNA 核酸提取試劑盒配套使用。

2．實(shí)驗(yàn)過程中進(jìn)行陰性對(duì)照和陽性對(duì)照樣品的

質(zhì)量控制。

3．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實(shí)驗(yàn)室。

4．PCR 整個(gè)試驗(yàn)分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)。流程順序?yàn)榕湟簠^(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò)增

區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。

5．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲(chǔ)存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)完全融化，8000rpm 離心

15s，使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時(shí)移液器吸頭盡量在液體表面層吸取， 使用后立即放回-20℃。

6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。

7．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時(shí)等全部過程必須精確。

配制，整個(gè)實(shí)驗(yàn)過程嚴(yán)格控制污染。

9．反復(fù)凍融試劑將降低檢測(cè)靈敏度，本試劑盒應(yīng)在 3 次內(nèi)用完。

【樣品采集】

病死或撲殺動(dòng)物，取水泡皮及水泡液；待檢活動(dòng)物，取 OP 液 2～3 mL。2～8 ℃保存，送實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。要求送檢病料新鮮，嚴(yán)禁反復(fù)凍融。

【實(shí)時(shí)熒光 RT-PCR 操作】

設(shè)被檢樣品、陰性對(duì)照和陽性對(duì)照總和為 N， 則反應(yīng)體系配制如下：

試劑體系

無菌無核酸酶水7（N+1）µL

RT-PCR 反應(yīng)液12.5（N+1）µL

酶混合液1（N+1）µL

  熒光探針2.5（N+1）µL

將以上配制的反應(yīng)體系充分混勻后，分裝每個(gè)反應(yīng)管中各 23µL。分別取 2µL 模板 RNA，加入相應(yīng)反應(yīng)管中，混勻并作好標(biāo)記，其中 SVV 熒光報(bào)告基團(tuán)為 FAM，淬滅基團(tuán)均為 None。在熒光 PCR 儀上進(jìn)行以下反應(yīng)：42 ℃ 5 min，95 ℃ 10 s；95 ℃ 5 s，60 ℃ 35 s，在每個(gè)循環(huán)第二步（60℃

35s）收集熒光信號(hào)，共 40 個(gè)循環(huán)。

【結(jié)果判定】

1 結(jié)果分析條件設(shè)定

閾值設(shè)定原則：閾值線設(shè)定于剛好超過陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線的最高點(diǎn)。不同儀器可根據(jù)儀器噪音情況進(jìn)行調(diào)整。                          2 結(jié)果描述及判定

陽性對(duì)照 Ct 值≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線， 陰性對(duì)照無 Ct 值并且無特異性擴(kuò)增曲線，實(shí)驗(yàn)結(jié)果成立；被檢樣品若 FAM 熒光信號(hào) Ct 值≤30 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線為 SVV 陽性；被檢樣品 30

＜Ct＜36 并出現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，需重新取樣提取 RNA，擴(kuò)增后進(jìn)行結(jié)果判定，如仍是可疑，可判定為陽性；被檢樣品 Ct 值≥36 時(shí)，超過本方法檢測(cè)靈敏度范圍，判定為陰性；對(duì)于某些未呈現(xiàn)特異性擴(kuò)增曲線，但本底較高的樣品，判為陰性。

【規(guī)格】50 頭份/盒

【保存及有效期】于-20℃以下保存，有效期為 12

個(gè)