產(chǎn)品及特點(diǎn)
本試劑盒可用于檢測食品或其他材料中是否有香菇源性成分。現(xiàn)代食品加工工藝極大改變了食材原有的味道、氣味、色澤、紋理和質(zhì)地等特性，因此傳統(tǒng)的感官鑒別技術(shù)已經(jīng)無法對(duì)食材的真?zhèn)芜M(jìn)行準(zhǔn)確的鑒定。同時(shí)部分食材還有致敏性，因此基于基因檢測的快速靈敏的食材來源檢測技術(shù)將對(duì)食品監(jiān)管和安全提供重要的保障。本公司開發(fā)了簡單快捷的香菇源性成分探針法熒光定量 PCR 檢測試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2.根據(jù)香菇保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物和探針，能專一性地檢測出樣品中的香菇成分， 但不能檢測其他非香菇成分。
3.提供陽性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.一管式閉管操作，降低了交叉污染。
5.快速，整個(gè)檢測過程（按一個(gè)樣品計(jì)）所需時(shí)間僅為 2.0 小時(shí)。
6.對(duì)混合樣品中香菇成分的檢測下限為 0.01%，對(duì)樣品中香菇成分的核酸檢測下限為 0.1ng/μL。
7.本產(chǎn)品只能用于科研，足夠 50 次 20μL 體系的熒光定量 PCR
運(yùn)輸及保存：低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為 12 個(gè)月。
自備試劑：樣品 DNA。
| 成分 | 編號(hào) | 十孔盒包裝 |
| 2×Probe qPCR Magic Mix | 190303 | 500 μL（本色蓋） |
| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
| 香菇源性成分探針法 qPCR 引物混 合液 | 15-441yw | 100 μL（白蓋） |
| 香菇源性成分 qPCR 探針 | 15-441pb | 50 μL（棕色管） |
| 香菇源性成分探針法 qPCR 陽性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL) | 60908-441pc | 50 μL（黃蓋） |
使用方法
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）
1. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭， 下同）。
3.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7.如果有 N 個(gè)樣品，最好設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽性對(duì)照），一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）。可以用 10μL 陽性對(duì)照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8.用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè) PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于 PCR 陽性對(duì)照（用第 4 號(hào)管的陽性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對(duì)照，并且陽性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
| 成分 | 樣品管 N+2 個(gè) | PCR 陰 性對(duì)照管 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線 樣品管（2-7 管） |
| 2×Probe qPCR MagicMix | 10μL | 10μL | 各 10 μL |
| 香菇源性成分 qPCR 探針 | 1μL | 1μL | 各 1μL |
| 香菇源性成分探針法 qPCR 引物 混合液 | 2μL | 2μL | 各 2μL |
| N+2 個(gè)待測 DNA 模板 | 7μL | - | - |
| 超純水 | - | 7μL | - |
| 第 7 步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 （2-7 號(hào)） | - | - | 各 7μL（2 號(hào)樣到2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 |
11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR：
| 過程 | 溫度 | 時(shí)間 |
| 預(yù)變性 | 95℃ | 5 min |
| PCR 反應(yīng) （40 個(gè)循環(huán)） | 95℃ | 15sec |
|
| 60℃ | 1 min（采集 FAM 通道的熒 光信號(hào)） |
四、數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對(duì)照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
13.如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對(duì)待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct值小于 40，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性。
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