pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針)是自行研發(fā)的含有CMV啟動(dòng)子用于在哺乳動(dòng)物線粒體中表達(dá)帶有線粒體定位信號(hào)(Mitochondrial localization signal, MLS)的AT1.03蛋白以作為細(xì)胞核ATP熒光探針的工具質(zhì)粒。本質(zhì)粒表達(dá)的ATP熒光探針被稱為ATeam，即基于FoF1-ATP合成酶ε亞基的ATP指示劑(Adenosine 5'-Triphosphate indicator based on Epsilon subunit for Analytical Measurements)。AT1.03是一種低親和力的ATeam (Kd=3.3mM at 37℃)，可以檢測(cè)毫摩爾級(jí)的ATP水平。pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒在轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞后，AT1.03蛋白由于帶有線粒體定位信號(hào)主要分布在線粒體中，適合用于實(shí)時(shí)監(jiān)控線粒體內(nèi)的ATP濃度變化。
pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針)也可以用作線粒體熒光探針，在活細(xì)胞中或細(xì)胞固定后標(biāo)記線粒體的位置和形態(tài)。
AT1.03蛋白是以熒光共振能量轉(zhuǎn)移(fluorescence resonance energy transfer, FRET)為基礎(chǔ)的實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)單個(gè)活細(xì)胞內(nèi)的ATP水平及其實(shí)時(shí)變化的ATP熒光探針。帶有線粒體定位信號(hào)的該熒光探針由N端的青色熒光蛋白(cyan fluorescent protein) mseCFPΔC11 (激發(fā)光波長(zhǎng)435nm，發(fā)射光波長(zhǎng)475nm)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)的FoF1-ATP合成酶的ε亞基以及C端的黃色熒光蛋白(yellow fluorescent protein) cp173-mVenus (激發(fā)光波長(zhǎng)515nm，發(fā)射光波長(zhǎng)527nm)融合而成(參考圖1)。枯草芽孢桿菌的FoF1-ATP合成酶的ε亞基是幾乎最小的ATP結(jié)合蛋白(14kDa)，它由一個(gè)N端β桶狀結(jié)構(gòu)域和兩個(gè)C端α螺旋結(jié)構(gòu)域組成。作為基于FRET的ATP熒光探針，F(xiàn)oF1-ATP合成酶的ε亞基具有幾個(gè)突出優(yōu)點(diǎn)：ε亞基與ATP結(jié)合，但不水解ATP；結(jié)合ATP，但不結(jié)合ADP、GTP、CTP以及UTP；當(dāng)ATP結(jié)合時(shí)，ε亞基發(fā)生很大的構(gòu)象變化形成一個(gè)折疊的構(gòu)象(folded form)，從而使N端的青色熒光蛋白以及C端的黃色熒光蛋白得以在空間上接近，而發(fā)生熒光共振能量轉(zhuǎn)移(激發(fā)光波長(zhǎng)435nm，發(fā)射光波長(zhǎng)527nm)。帶有線粒體定位信號(hào)的AT1.03蛋白和不帶有線粒體定位信號(hào)的AT1.03蛋白相比，完全保留了AT1.03蛋白的以FRET為基礎(chǔ)的ATP熒光探針的功能。
圖1.Mito-AT1.03蛋白結(jié)構(gòu)圖，N端融合了線粒體靶向信號(hào)(細(xì)胞色素c氧化酶VIII雙鏈體)。Cox x2為線粒體定位信號(hào)。
pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的ATP熒光探針表達(dá)效果請(qǐng)參考圖2。
圖2.pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞后的ATP熒光探針表達(dá)效果圖。A圖為明場(chǎng)照片，B圖為熒光照片。
AT1.03的熒光信號(hào)在pH7.1-8.5之間非常穩(wěn)定，這樣AT1.03的熒光信號(hào)在正常細(xì)胞質(zhì)內(nèi)(pH7.3左右)幾乎不會(huì)發(fā)生波動(dòng)。ATP的結(jié)合常數(shù)Kon為1.7×10-2mM-1s-1，ATP的解離常數(shù)Koff為9.8×10-2s-1，因此AT1.03可用于監(jiān)控細(xì)胞內(nèi)高達(dá)0.1s-1 ATP的動(dòng)態(tài)變化，特別適合用于實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)超短時(shí)間內(nèi)的ATP濃度變化。帶有線粒體定位信號(hào)的AT1.03蛋白和不帶有線粒體定位信號(hào)的AT1.03蛋白相比，pH穩(wěn)定性、結(jié)合常數(shù)、解離常數(shù)等性能基本一致。
本質(zhì)粒為卡那霉素抗性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 1–602 |
| T3 promoter and T3 primer binding site | 620–639 |
| Mito-AT1.03 | 699-2702 |
| multiple cloning site | 651-692/2703-2726 |
| T7 promoter and T7 primer binding site | 2749–2797 |
| SV40 polyA signal | 2809–3192 |
| f1 origin of ss-DNA replication | 3330–3634 |
| bla promoter | 3659–3783 |
| SV40 promoter | 3803–4141 |
| neomycin/kanamycin resistance ORF | 4176–4967 |
| HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal | 4968–5426 |
| pUC origin | 5555–6222 |
pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒(6274bp)的圖譜如下：
pCMV-Mito-AT1.03中沒有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pCMV-Mito-AT1.03)包括：
| AclI | AfeI | AflII | AgeI | AhdI | AscI | AsiSI |
| BaeI | BbsI | BbvCI | BlpI | BsiWI | BsmBI | BspEI |
| BspQI | BstEII | BstZ17I | EarI | EcoNI | Esp3I | FseI |
| HindIII | NruI | PmeI | PmlI | PpuMI | PshAI | PspXI |
| SalI | SapI | SbfI | ScaI | SgrAI | SwaI | XcmI |
| XmnI |
pCMV-Mito-AT1.03中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pCMV-Mito-AT1.03)包括：
| AccI | GT`MK,AC | 1600 | NdeI | CA`TA,TG | 240 |
| ApaLI | G`TGCA,C | 5908 | NheI | G`CTAG,C | 597 |
| BamHI | G`GATC,C | 687 | NotI | GC`GGCC,GC | 668 |
| BclI | T`GATC,A | 2963 | PaeR7I | C`TCGA,G | 2709 |
| BglII | A`GATC,T | 2703 | PciI | A`CATG,T | 6222 |
| BmgBI | CAC|GTC | 1940 | PflFI | GACN`N,NGTC | 4422 |
| BmtI | G,CTAG`C | 597 | PflMI | CCAN,NNN`NTGG | 863 |
| BsaI | GGTCTCN`NNNN, | 5293 | PluTI | G,GCGC`C | 4303 |
| BsaXI | ,NNN`(N)9AC(N)5CTCC(N)7,NNN` | 3353 | PvuI | CG,AT`CG | 2807 |
| BsrDI | GCAATG,NN` | 4535 | RsrII | CG`GWC,CG | 4820 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 2158 | SacI | G,AGCT`C | 651 |
| BstBI | TT`CG,AA | 4986 | SacII | CC,GC`GG | 660 |
| BstXI | CCAN,NNNN`NTGG | 663 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 4076 |
| CspCI | ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 380 | SfoI | GGC|GCC | 4305 |
| DraIII | CAC,NNN`GTG | 3419 | SmaI | CCC|GGG | 682 |
| Eco53kI | GAG|CTC | 653 | SnaBI | TAC|GTA | 346 |
| EcoRI | G`AATT,C | 1959 | SpeI | A`CTAG,T | 2721 |
| EcoRV | GAT|ATC | 1613 | SrfI | GCCC|GGGC | 682 |
| HincII | GTY|RAC | 3069 | StuI | AGG|CCT | 4125 |
| HpaI | GTT|AAC | 3069 | TspMI | C`CCGG,G | 680 |
| KasI | G`GCGC,C | 4303 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 4422 |
| MfeI | C`AATT,G | 3056 | XbaI | T`CTAG,A | 2715 |
| MluI | A`CGCG,T | 3192 | XhoI | C`TCGA,G | 2709 |
| MscI | TGG|CCA | 4386 | XmaI | C`CCGG,G | 680 |
| NarI | GG`CG,CC | 4304 |
如需對(duì)pCMV-Mito-AT1.03質(zhì)粒中插入片段Mito-AT1.03進(jìn)行測(cè)序時(shí)，推薦使用的正向測(cè)序引物T3和反向測(cè)序引物T7的序列如下：
T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'
T7 primer (2749–2797): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'
包裝清單：
| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D2606-1μg | pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針) | 1μg |
| D2606-100μg | pCMV-Mito-AT1.03 (線粒體ATP熒光探針) | 100μg |
| － | 說明書 | 1份 |
保存條件：
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：
本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途，也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個(gè)人或單位。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.首次使用1µg包裝的本產(chǎn)品時(shí)，請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過酶切電泳進(jìn)行鑒定，或通過測(cè)序進(jìn)行鑒定。
2.100µg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1µg/µl，共1ml。可以直接用于酶切或者轉(zhuǎn)染細(xì)胞。
