偽狂犬病病毒(Pseudorabies Virus，PrV) 會引起偽狂犬病，病豬的臨床癥狀和病程隨年齡不同而有很大差異：哺乳仔豬最為敏感，15 日齡以內(nèi)的仔豬常表現(xiàn)為最急性型，主要表現(xiàn)為體溫升高、拉稀、發(fā)抖、運動不協(xié)調(diào)、流涎、頸部肌肉僵硬、四肢劃水樣運動，最后昏迷死亡；育肥豬則大多數(shù)伴有體溫升高，呼吸困難，一般不發(fā)生死亡，耐過后呈長朗隱性感染帶毒或排毒；成年豬常不呈現(xiàn)可見臨床癥狀或僅表現(xiàn)為輕微體溫升高，一般不發(fā)生死亡。母豬妊娠初期，可在感染后的 20 天左右發(fā)生流產(chǎn)，在妊娠后期，經(jīng)常發(fā)生死胎和木乃伊，或者產(chǎn)出弱胎和死胎。在完成豬瘟凈化的地區(qū)，偽狂犬病被認為是對經(jīng)濟影響最大的豬病毒病，因此偽狂犬病病毒的快速準確鑒定對該病的預防和檢疫有著重要作用，為此本公司開發(fā)了簡單快捷的偽狂犬病病毒探針法熒光定量 PCR 檢測試劑盒，它具有下列特點：
1. 即開即用，用戶只需要提供樣品 DNA 模板。
2. 引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，靈敏性高。
3. 提供陽性對照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4. 特異性高，引物是根據(jù)偽狂犬病病毒設(shè)計，不會跟其他病毒株 DNA 發(fā)生交叉反應(yīng)。
5. 本產(chǎn)品足夠 50 次 20μL 體系的探針法熒光定量 PCR 反應(yīng)。
本產(chǎn)品只能用于科研。
| | 成分 | 編號 | 十孔盒包裝 |
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| 2×Probe qPCR Magic Mix | 190303 | 500 μL（本色蓋） |
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| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 180701 | 1 mL（黃蓋） |
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| 偽狂犬病病毒探針法 qPCR 引物 混合液 | 同 15-35100yw | 100 μL（白蓋） |
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| 偽狂犬病病毒 qPCR 探針 | 同 15-35100pb | 50 μL（棕色管） |
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| 偽狂犬病病毒探針法 qPCR 陽性對照 (1×10E8 拷貝/μL) | 同 60908- 35100pc | 50 μL（黃蓋） |
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| 使用手冊 | 同 15-35100sc | 1 份 |
| 低溫運輸，-20℃保存，保存期限為 12 個月。 | |||
| 樣品 DNA。 | |||
一、稀釋標準曲線樣品（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個 10 倍稀釋度為例）。由于標準品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行，千萬不能
污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴散傳染性病原， 本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽性對照，只提供無傳染性的 DNA 片段作為陽性對照。1.標記 6 個離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
2. 用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同）。
3. 在 7 號管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽性對照(試劑盒提供)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
4. 換槍頭，在 6 號管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
5. 換槍頭，在 5 號管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得)，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的標準曲線樣品。放冰上待用。
6. 重復上面的操作直到得到 6 個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
7. 如果有 N 個樣品，最好設(shè)置 N+2 個提取，多出的一個是 PC（樣品制備陽性
對照），一個是 NC（樣品制備陰性對照）�？梢杂� 10μL 陽性對照的 10000 倍稀釋液再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣，以此作為PC。另外用水作為 NC。
8. 用自選方法純化樣品的 DNA，本試劑盒跟市場上大多數(shù) DNA 提取試劑盒兼容。
三、Probe qPCR 反應(yīng)（20μL 體系，在樣品制備室進行）
9. 如果做定量分析并且只做 1 次重復，則標記 N+9 個 PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），6 個用于標準曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復，則標記 N+4 個PCR 管，其中 N+2 個用于上步得到的 N+2 個樣品，1 個用于 PCR 陰性對照（用水做模板），1 個用于 PCR 陽性對照（用第 4 號管的陽性對照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10. 在標記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復。樣品管和陰性對照設(shè)
11. 蓋上蓋子后上機，按下面參數(shù)進行 PCR：
置完畢后才設(shè)置陽性對照，并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加）：
| | N+2 個 | 性對照管 | 樣品管（2-7 管） |
| 2×Probe qPCR Magic Mix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 偽狂犬病病毒 qPCR 探針 | 1 μL | 1 μL | 各 1 μL |
| 偽狂犬病病毒探針法 qPCR 引物 混合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 個待測 DNA 模板 | 7 μL | - | - |
| 超純水 | - | 7 μL | - |
| 第 7 步所得標準曲線樣品稀釋液 （2-7 號） |
- |
- | 各 7 μL（2 號樣到 2 號管，3 號樣到 3 號管…） |
四、數(shù)據(jù)處理
11. 如果把本試劑盒用于定量檢測，則以陽性對照濃度的 log 值為橫軸，以 Ct 值為縱軸，繪制標準曲線。再以待測樣品的 Ct 值從標準曲線上推算出樣品 RNA 濃度的 log 值，再推算出其濃度。
12. 如果把本試劑盒用于定性檢測，只判斷陽性或陰性，則陰性對照 Ct 必須大于或等于 40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長，有典型擴增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于 30。對待測樣品，如果其 Ct 大于或等于 40 則為陰性，如果小于或等于 35 則為陽性。如果在 35-40 之間，則重復一次。若重復結(jié)果 Ct
值小于 40，擴增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽性，否則為陰性
