儲存條件
收到SuperReal 熒光定量預混試劑 增強版后，請立即置于-20℃避光保存。從-20℃取出使用時，將凍存的2×SuperReal PreMix Plus 和50×ROX Reference Dye融解，然后輕輕顛倒混勻，待溶液完全均一后再行使用。如解凍后沒有使用，須徹底混勻后重新冷凍(在解凍過程中鹽會出現(xiàn)分層現(xiàn)象，未混勻進行冷凍，鹽晶體的析出將會對酶造成損害)。如需一段時間內經(jīng)常取用，可在2～8℃條件下儲存3個月。避免反復多次凍融。
產(chǎn)品簡介
本產(chǎn)品是采用SYBR Green I嵌合熒光法進行Real Time PCR的專用試劑。產(chǎn)品中預先混有Real Time PCR反應所需合適濃度的SYBR Green I，是一種2×濃度的PreMix，反應液配制十分簡單方便。
SuperReal PreMix Plus采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶(化學修飾的HotStar Taq
DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶)，配合精心優(yōu)化buffer體系，具有高擴增效率，高擴增特異性和寬廣的可信范圍的特點。本升級版試劑在經(jīng)過成分調整后，擴增特異性上的優(yōu)勢更為突出。
試劑盒特點
1. SuperReal PreMix Plus采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶(化學修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶)，從而構成酶活自動調節(jié)系統(tǒng)，配合精心優(yōu)化buffer體系，具有高擴增效率，高擴增特異性和寬廣的可信范圍的特點。
2. 
本產(chǎn)品Buffer體系平衡了K+和NH +的比例，還特別添加了獨特的H-Bond因子, 能協(xié)同調整反應體系中的氫鍵作用力，使引物模板退火條件更加嚴謹，反應的專一性增強，重復性更好。
3. SuperReal PreMix Plus中預混有SYBR Green I，PCR反應液配制時，只需加入模板、引物、滅菌蒸餾水便可進行Real Time PCR反應，操作簡單方便。
4. 本產(chǎn)品附帶ROX Reference Dye，用于消除信號本底以及校正孔與孔之間產(chǎn)生的熒光信號誤差，方便客戶針對不同型號熒光定量PCR儀時選擇對應濃度使用。
試劑盒原理
本產(chǎn)品采用了獨特的雙組分熱啟動DNA聚合酶進行PCR擴增，通過檢測反應進程中
SYBR Green I的熒光強度，達到檢測PCR產(chǎn)物擴增量的目的。
本產(chǎn)品中雙熱啟動酶構成了獨特的酶活自動調節(jié)系統(tǒng)。酶活自動調節(jié)系統(tǒng)是由化學修飾的HotStar Taq DNA聚合酶和抗體修飾的Anti Taq DNA聚合酶組成。其中HotStar Taq DNA 聚合酶占絕大部分比例，其聚合酶活性的激活是嚴格依賴于95℃高溫的一個緩釋過程，而Anti Taq DNA聚合酶則在95℃高溫下完全激活。經(jīng)過95℃條件下孵育15 min激活大部分HotStarTaq DNA聚合酶，進入PCR循環(huán)后，每經(jīng)過一輪95℃條件下變性，即可重新激活一部分HotStar Taq DNA聚合酶。HotStar Taq DNA聚合酶獨特的酶活緩釋機制使其可以與Anti Taq DNA聚合酶構成獨特的酶活自動調節(jié)系統(tǒng)。PCR反應初期，完全激活的Anti Taq DNA聚合酶可以協(xié)同已經(jīng)激活的HotStar Taq DNA聚合酶達到優(yōu)化酶活狀態(tài)，而在整個PCR反應過程中，每一輪新釋放的HotStart Taq DNA聚合酶活力剛好可以彌補因熱變性所導致的部分酶活損失。因此，SuperReal PreMix Plus在整個PCR反應過程始終保持優(yōu)化的DNA聚合酶活力，配合精心優(yōu)化Buffer體系，從而可以獲得高擴增效率，高擴增特異性和更加廣泛性的模板適應性。
注意事項
1. PCR反應的預變性條件必須設定為95℃ 15 min，用以充分激活熱啟動酶。
2. 本產(chǎn)品中含有熒光染料SYBR Green I，保存本產(chǎn)品或配制PCR反應液時應避免強光照射。
3. 如果試劑沒有混勻，其反應性能會有所下降。使用時請上下顛倒輕輕混勻，請不要使用振蕩器進行混勻，盡量避免出現(xiàn)泡沫，并經(jīng)瞬時離心后使用。
4. 引物純度對反應特異性影響很大，建議使用PAGE級別以上純化的引物。
5. 引物終濃度為0.3 μM可以在大多數(shù)體系中獲得良好的擴增結果。如果需要進一步優(yōu)化， 可以在 0.2-0.5 μM范圍內調整引物濃度。
μl反應體系中，基因組DNA或cDNA模板的使用量一般小于100 ng，逆轉錄產(chǎn)物作為模板時，使用量應不超過PCR體系終體積的20%。
進行Real Time PCR反應時，PCR引物的設計非常重要。設計PCR擴增效率高，反應特異性強的引物可以參考以下要求
| 引物長度 | 18-30個堿基 |
| GC含量 | 40-60% |
| Tm值 | 引物軟件都可以給出Tm，與引物長度，堿基組成，引物使用緩沖的離子強度也有關。 上下游引物的Tm值要盡量接近。 簡單的Tm計算公式為：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T)。一般采用較引物Tm值低5℃作為PCR退火溫度。 提高退火溫度可以增加PCR反應的特異性。 |
| 引物及PCR擴增產(chǎn)物序列 | PCR擴增產(chǎn)物適宜長度在80-200 bp之間。盡量避開在模板的二級結構區(qū)域設計引物。 避免上下游引物3′端之間形成2個或以上的互補堿基以減少引物二聚體的形成。 引物3'端堿基不能有多于3個連續(xù)的G或C。 引物自身不應存在互補序列，否則引物自身會折疊成發(fā)夾狀結構。 避免引物3'末端堿基為T。 引物序列中A、T、G、C要盡量均勻分布。 |
常見問題
１．無擴增信號或擴增曲線起峰晚或僅有引物二聚體
| 原因 | 解決辦法 |
| DNA模板中存在抑制劑 | 重新純化模板或降低模板使用量 |
| Mg2＋濃度不合適 | 使用2×SuperReal PreMix Plus時，PCR反應體系中Mg2＋ 的終濃度為2 mM。對有些擴增體系，可以將Mg2＋終濃度提高到5 mM。進行Mg2＋終濃度優(yōu)化時，建議每次增加0.5 mM Mg2＋濃度進行實驗。 |
| 加樣錯誤或試劑問題 | 檢查試劑濃度和保存條件，包括所使用的引物和模板。重復 進行實驗。 |
| 熱啟動酶未能激活 | 使用試劑時，請確保預變性條件為95℃ 15 min，用以有效激活熱啟動DNA聚合酶。 |
| PCR 條件、引物序列或濃度不當 | 請確認引物未發(fā)生降解，引物濃度及PCR 條件，擴增不好時，通常先嘗試降低退火溫度，延長退火時間和提高引物濃度，有時也可以提高退火溫度，增加延伸時間，降低升溫 速度。對于GC 含量高的模板，可以適當延長變性時間。 如果還是擴增不好，請重新設計引物。 |
| 起始模板問題 | 檢查起始模板的濃度，保存條件和質量。重新對模板進行線性梯度稀釋，并用新稀釋模板進行實驗。增加起始模板使用量。 |
