蘭花花葉病毒RT-PCR試劑盒具有下列特點(diǎn)：
1.即開(kāi)即用，用戶只需要提供 DNA 模板。
2.引物根據(jù) EB 病毒專一區(qū)設(shè)計(jì)，特異性高。
3.熒光定量PCR 檢測(cè)，比常規(guī) PCR 更加靈敏。
4.一管式閉管操作，降低了交叉污染。
5.本試劑盒足夠 50 次 20μL 反應(yīng)體系的熒光定量 PCR。
本產(chǎn)品只適用于科研，不能用于臨床診斷
| 成分 | 十孔盒包裝 |
| 2×qPCR Magic Mix | 500 μL（棕色管） |
| 熒光PCR 專用模板稀釋液 | 1 mL（黃蓋） |
| 病毒染料法 qPCR 引物混合液 | 100 μL（白蓋） |
| 病毒染料法 qPCR 陽(yáng)性對(duì)照 (1×10E8 拷貝/μL) | 50 μL（黃蓋） |
| 使用手冊(cè) | 1 份 |
運(yùn)輸及保存:低溫運(yùn)輸、-20℃保存，有效期一年。
自備試劑:DNA 模板、超純水、10×ROX（根據(jù)機(jī)型決定，具體見(jiàn)使用方法）。
使用方法 一、稀釋 PCR 陽(yáng)性對(duì)照（以 10E2-10E7 拷貝/μL 這 6 個(gè) 10 倍稀釋度為例）
1. 注意：由于陽(yáng)性對(duì)照濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分）。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供可以直接使用的 DNA 片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
2. 標(biāo)記 6 個(gè)離心管，分別為 7，6，5，4，3，2。
3.用帶芯槍頭分別加入 45 μL 熒光 PCR 專用模板稀釋液（最好用帶芯槍頭，下同）。
4.在 7 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E8 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
5.換槍頭，在 6 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E7 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，
充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
6.換槍頭，在 5 號(hào)管中加入 5 μL 1×10E6 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照到 5 號(hào)管中，充分震蕩 1 分鐘，得 1×10E5 拷貝/μL 的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。
7.重復(fù)上面的操作直到得到 6 個(gè)稀釋度的陽(yáng)性對(duì)照。放冰上待用。二、樣品 DNA 的制備
8.如果有 N 個(gè)樣品，必須設(shè)置 N+2 個(gè)提取，多出的一個(gè)是 PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照），
一個(gè)是 NC（樣品制備陰性對(duì)照）�？梢杂� 10μL PCR 陽(yáng)性對(duì)照的 10000 倍稀釋的（稀釋后濃度為 1×10E4 拷貝/μL，10μL 相當(dāng)于 1 萬(wàn)拷貝，可以將 10μL 原液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 100 倍稀釋液。再取 10μL 此稀釋液加入到 990μL 自備 TE 溶液中，充分混勻，此為 10000 倍稀釋液）再加上一定量的水作為制備的陽(yáng)性對(duì)照（加水后其總體積跟樣品一樣，樣品體積多少取決于所用試劑盒的要求）�？梢杂盟鳛橹苽涞年幮詫�(duì)照。制備所得成為樣品 DNA。
9.用自選方法純化 N+2 個(gè)樣品的 DNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)核酸提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置 qPCR 反應(yīng)（20 μL 體系，在樣品制備室進(jìn)行）
10.如果做定量分析并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+9 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的 N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于 PCR 陰性對(duì)照，6 個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析，并且只做 1 次重復(fù)，則標(biāo)記 N+4 個(gè)PCR 管，其中 N+2 個(gè)用于上步得到的N+2 個(gè)樣品，1 個(gè)用于PCR 陰性對(duì)照（用水做模板），1 個(gè)用于PCR 陽(yáng)性對(duì)照（用第 4 號(hào)陽(yáng)性對(duì)照稀釋液，濃度為 14810 拷貝/μL）。下面只描述定量分析的步驟， 定性分析只是把 6 個(gè)標(biāo)曲反應(yīng)縮減成 1 個(gè)，其余不變。
11.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢
后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）
| 成分 | 樣品管 N+2 個(gè) | PCR 陰性 對(duì)照管 | PCR 陽(yáng)性 對(duì)照管（2-7 管） |
| 2×qPCR MagicMix | 10 μL | 10 μL | 各 10 μL |
| 染料法qPCR 引物混 合液 | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| 自備 10×ROX (見(jiàn)注) | 2 μL | 2 μL | 各 2 μL |
| N+2 待測(cè)樣品 cDNA 模板 | 6 μL | - | - |
| 自備超純水 | - | 6 | - |
| 第 7 步所得 PCR 陽(yáng)性對(duì)照稀釋液（2-7 號(hào)） | - | - | 各 6μL（2 號(hào)樣到 2 號(hào)管，3 號(hào)樣到 3 號(hào)管…） |
注:僅 ABI7500、7700 和 7900 儀器需要使用ROX 作為對(duì)照，其他熒光 PCR 儀器（如 iCycler IQ、MJ Option、MJ Chromo4、MX3000、MX4000、RotorGene 3000、RotorGene 6000 和 LightCycler480）不需要使用 ROX，則用水替代。
12. 蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行 PCR（具體 PCR 參數(shù)可以根據(jù)儀器不同而自行優(yōu)化）。
四、數(shù)據(jù)處理
13.如果把蘭花花葉病毒RT-PCR試劑盒軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
14.如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照 Ct 必須大于或等于 36。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct 值應(yīng)該小于或等于30。對(duì)待測(cè)樣品，如果其 Ct 大于或等于 34 則為陰性，如果小于或等于 30 則為陽(yáng)性。如果在 30-34 之間，則重復(fù)一次。若重復(fù)結(jié)果 Ct 值小于 34，擴(kuò)增曲線有明顯起峰，該樣本判斷為陽(yáng)性，否則為陰性軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的 Ct 值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品 cDNA 濃度的log 值，再推算出其濃度。
