禽流感病毒 H5 亞型 RT-PCR 檢測試劑盒使用說明書
用途禽流感病毒 H5 亞型（AIV-H5）反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（RT－PCR）檢測試劑盒，用于檢測 禽組織、分泌物和排泄物中的 AIV-H5，適用于 AIV-H5 的診斷、檢測和流行病學(xué)調(diào)查。
原理 利用離心柱內(nèi)硅基質(zhì)膜提取 RNA，在反轉(zhuǎn)錄酶的作用下，以 RNA 為模板，以引物為起點
合成與 RNA 模板互補的 cDNA 鏈。在 TaqDNA 聚合酶的作用下，經(jīng)高溫變性、低溫退火、中溫延 伸的循環(huán)，使特異 DNA 片段的拷貝數(shù)放大一倍。經(jīng)過 35 次循環(huán)，最終使擴(kuò)增 DNA 片段放大了數(shù) 百萬倍。將擴(kuò)增 DNA 片段進(jìn)行電泳，經(jīng)染色后，在紫外燈照射下，肉眼可見到 DNA 片段的擴(kuò)增帶。
試劑盒組成
| 名稱 | 10 頭份 | 50 頭份 | 貯藏條件 |
| 0.2 mL 薄壁 PCR 管 | 15 個 | 60 個 |
室溫（A 盒） |
| 吸附柱和收集管 | 10 套 | 50 套 | |
| 裂解液 | 6 mL | 30 mL | |
| 洗液 | 12 mL | 60 mL | |
| 洗脫液 | 1 mL | 10 mL | |
| 礦物油 | 300 µL | 1.2 mL | |
| 50 倍 TAE 電泳緩沖液（50 倍稀釋后使用） | 20 mL | 100 mL | |
| 染色液 | 20 µL | 50 µL | |
| 上樣緩沖液 | 50 µL | 250 µL | |
| 陰性對照 | 350 µL | 1 mL |
-20 ℃（B 盒） |
| 陽性對照 | 350 µL | 1 mL | |
| RT-PCR 反應(yīng)液 | 200 µL | 1 mL | |
| X 液 | 5 µL | 10 µL | |
| 酶混合液 | 15 µL | 65 µL |
保存期本產(chǎn)品有效期為 6 個月。
需自備的物品
1．儀器：分析天平、離心機(jī)、PCR 擴(kuò)增儀、電泳儀、電泳槽、紫外凝膠成像儀（或紫外分析儀）、 微波爐、組織研磨器、-20 ℃冰箱、可調(diào)移液器（2 µL、20 µL、200 µL、1000 µL）。 2．耗材：眼科剪、眼科鑷、稱量紙、20 mL 一次性注射器、生理鹽水、瓊脂糖、500 mL 量筒、500 mL 錐形瓶、經(jīng)焦碳酸二乙酯（DEPC）水處理的滅菌 1.5mL 離心管和吸頭（10 µL、200 µL、1000 µL）、 滅菌雙蒸水。
注意事項
1．所有接觸病料的物品均應(yīng)合理處置，以免污染實驗室。
2．PCR 整個試驗分配液區(qū)、模板提取區(qū)、擴(kuò)增區(qū)、電泳區(qū)。流程順序為配液區(qū)→模板提取區(qū)→擴(kuò) 增區(qū)→電泳區(qū)。嚴(yán)禁器材和試劑倒流。
3．所有試劑應(yīng)在規(guī)定的溫度儲存。-20℃保存的各試劑管使用前應(yīng)完全融化，8000 rpm 離心 15 s， 使液體全部沉于管底，放于冰盒中，吸取液體時移液器吸頭盡量在液體表面層吸取，使用后立 即放回-20 ℃。
4．在 RNA 提取過程中，避免 RNA 酶污染，盡量縮短操作時間。
5． 染色液低毒，操作時應(yīng)戴上手套，避光保存，較長時間不使用請存放于 4℃，以免揮發(fā)變干。 染色液和上樣緩沖液使用前也請離心使液體沉于管底。
6．注意防止試劑盒組分受污染。不要使用超過有效期限的試劑，試劑盒之間的成分不要混用。
7．嚴(yán)格遵守操作說明可以獲得最好的結(jié)果。操作過程中移液、定時等全部過程必須精確。
8．反復(fù)凍融試劑將減低檢測靈敏度，建議在 3 次內(nèi)用完，請嚴(yán)格按試劑盒說明書操作。
樣品制備
1 樣品采集：病死或撲殺禽，取喉氣管、腦、胸肌、心肌和肺等組織；待檢活禽，用棉拭子取呼吸 道分泌物或排泄物，置于 50%甘油生理鹽水中。2～8 ℃保存，送實驗室檢測。（要求送檢病料新鮮， 嚴(yán)禁反復(fù)凍融。）
2 樣品處理：每份樣品分別處理。
2.1 組織樣品處理：每份組織分別從三個不同的位置稱取樣品約 1g，用手術(shù)剪剪碎混勻后取 0.05 g 于研磨器中研磨，加入 1.5 mL 生理鹽水繼續(xù)研磨，待勻漿后轉(zhuǎn)至 1.5 mL 滅菌離心管中，8000 rpm 離心 2 min，取上清液 100 µL 于 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.2 全血樣品處理：待血凝后取血清 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.3 陽性對照處理：取陽性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
2.4 陰性對照處理：取陰性對照 100 µL，置 1.5 mL 滅菌離心管中。
操作步驟
1 病毒 RNA 的提取
1.1 取已處理的樣品、陰性對照和陽性對照，分別加入裂解液 600 µL，充分顛倒混勻，室溫靜置 3～
5 min。
1.2 將液體吸入吸附柱中（吸附柱要套上收集管，吸取液體時盡量不要吸到懸浮雜質(zhì)，以免離心時 堵塞吸附柱），13000 rpm 離心 30 s。
1.3 棄去收集管中液體，加入 600 µL 洗液，13000 rpm 離心 30 s。
1.4 重復(fù)步驟 1.3。
1.5 棄去收集管中液體，13000 rpm 空柱離心 2 min，以除去殘留的洗滌液。
1.6 將吸附柱移入新的 1.5 mL 離心管中，向柱中央加入洗脫液 50 µL，室溫靜置 1 min，13000 rpm
離心 30 s，離心管中液體即為模板 RNA。
2 RT-PCR 擴(kuò)增
每份總體積 20 µL，含 16.8 µL RT-PCR 反應(yīng)液（用前混勻），1.2 µL 酶混合液，2 µL 模板 RNA。 例如：n 份樣品，配制 n+1 份，16.8×（n+1）RT-PCR 反應(yīng)液，再加入 1.2×（n+1）酶混合液，
混勻后取 18 µL 分裝成 n 份，分別加入 2 µL 模板 RNA（陽性對照管加入 1 µL 陽性對照 RNA 和 1 µL X 液），加入礦物油 20 µL 覆蓋（有熱蓋的 PCR 擴(kuò)增儀不用加礦物油），作好標(biāo)記。
在 PCR 擴(kuò)增儀上進(jìn)行以下程序：42 ℃ 45 min，95 ℃ 3 min；循環(huán) 95 ℃ 30 s，50 ℃ 40 s，72 ℃
40 s，共 35 次；再 72 ℃延伸 10 min。
3 電泳
稱 3 g 瓊脂糖放于 500 mL 錐形瓶中，加入 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液 200 mL（取 4 mL 50 倍 TAE 電泳緩沖液，用雙蒸水稀釋至 200 mL），于微波爐中熔解，再加入 10 µL 染色液混勻。在電泳 槽內(nèi)放好梳子，倒入瓊脂糖凝膠，待凝固后將 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物 10 µL 混合 2 µL 上樣緩沖液，點樣于 瓊脂糖凝膠孔中，以 110～120V 電壓于 50 倍稀釋的 TAE 電泳緩沖液中電泳，紫外燈下觀察結(jié)果。
結(jié)果判定陽性對照出現(xiàn) 545 bp 擴(kuò)增帶、陰性對照無帶出現(xiàn)（引物帶除外）時，實驗結(jié)果成立。 被檢樣品出現(xiàn) 545 bp 擴(kuò)增帶為禽流感病毒 H5 亞型陽性，否則為陰性。
