超氧化物岐化酶(Superoxide Dismutase, SOD)是含金屬輔基的酶，能催化超氧化物陰離子發(fā)生岐化作用，生成過氧化氫(H2O2)和氧氣(O2)，是生物體內(nèi)一種重要的抗氧化酶；由于超氧自由基是不穩(wěn)定的的自由基，壽命極短，SOD活性一般用間接方法測定，并利用各種呈色反應(yīng)來測定SOD活力，其中顯色劑有NBT(四氮唑藍(lán))、WST-1、WST-8等。
雅吉生物總超氧化物歧化酶(SOD)檢測試劑盒(NBT核黃素微板法)(Total Superoxide Dismutase Assay Kit with NBT)是一種基于NBT的顯色反應(yīng)，通過比色來檢測組織、細(xì)胞、植物、血清或其它樣品中SOD即超氧化物歧化酶活性的試劑盒，其檢測原理是利用SOD抑制NBT在光照下的還原作用來確定酶活性大小。在有氧化合物存在的情況下，核黃素被光還原，后經(jīng)一系列的反應(yīng)可將NBT還原為藍(lán)色的甲臜(formazan)，后者在560nm處有強(qiáng)吸收，SOD可清除超氧陰離子(O2.-)，從而抑制了甲臜的形成，反應(yīng)液藍(lán)色愈深說明超氧化物岐化酶活性愈低，反之則酶活性愈高，據(jù)此通過比色分析就可以計(jì)算出超氧化物岐化酶活性水平。
該試劑盒僅用于科研領(lǐng)域，不適用于臨床診斷或其他用途。
三、自備材料：
生理鹽水或PBS
離心機(jī)、離心管、小試管
分光光度計(jì)、比色杯
水浴鍋或恒溫箱
四、操作步驟(僅供參考)：
1、 準(zhǔn)備樣品：
①血漿或含紅細(xì)胞的樣品：從待測樣品中分理出的血清或血漿不應(yīng)有溶血，如果含有應(yīng)去除紅細(xì)胞后檢測，如超過檢測范圍，用SOD提取液稀釋后檢測。血清去除紅細(xì)胞的簡易方法如下：用抗凝管收集血液，顛倒混勻，取至少500μl全血，4℃ 3000g離心5min，轉(zhuǎn)移上清至另一新的1ml離心管中，適量生理鹽水稀釋后待測；亦可采用紅細(xì)胞裂解液去除紅細(xì)胞，如Leagene ACK紅細(xì)胞裂解液等。
②組織樣品：動(dòng)物用含有20U/ml Heparin的生理鹽水(0.9% NaCl containing 20U/ml Heparin)灌流清除血液后獲取組織樣品。按照每100mg組織加入500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 4000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。
③細(xì)胞樣品：對于貼壁細(xì)胞，由于后續(xù)用于酶活性的測定，避免使用胰酶消化細(xì)胞�？梢允褂眉�(xì)胞刮或EDTA處理細(xì)胞并收集細(xì)胞，細(xì)胞用無菌的PBS或生理鹽水洗滌1次，按照每106細(xì)胞加入300～500μl SOD提取液的比例，用玻璃勻漿器在4℃或冰浴勻漿，4℃ 10000g離心10min，取上清液(SOD粗提液)用于酶活性的測定。
④植物樣品：準(zhǔn)確稱取植物材料(果肉或者去葉脈的葉片)0.4g，剪碎，置于4℃預(yù)冷的研缽或勻漿器中，加入預(yù)冷提取液1ml，低溫研磨至勻漿后轉(zhuǎn)移至離心管，用3ml提取液沖洗研缽或勻漿器并轉(zhuǎn)入離心管，加提取液至總體積為4ml，4℃ 10000r/min離心20min，上清液為酶提取液，上清液可用于SOD的檢測。注意：如果SOD酶活性較低，應(yīng)相應(yīng)減少提取液的總體積，以便提高SOD酶的濃度。
⑤上述樣品準(zhǔn)備完畢后可以BCA蛋白定量檢測試劑盒測定蛋白濃度，通常10-20μg蛋白的細(xì)胞或組織勻漿液樣品其中的SOD平均活力約1個(gè)活力單位左右(不同細(xì)胞和組織的差異會比較大，該活力范圍僅作為初步的參考)；每種樣品準(zhǔn)備20～100μg蛋白量通常已經(jīng)足夠用于后續(xù)檢測，根據(jù)蛋白濃度和預(yù)計(jì)的蛋白使用量，用該試劑盒提供的SOD提取液適當(dāng)稀釋樣品，例如小鼠肝臟組織10%勻漿液(組織和勻漿液的重量比為10%)上清，通常需要稀釋10～100倍，準(zhǔn)備好的樣品如果當(dāng)天測定，可以冰浴保存；如果當(dāng)天不能完成測定，可以-20℃凍存，但建議盡量當(dāng)天完成測定。
2、 配制NBT酶工作液：按照每個(gè)反應(yīng)1.6ml的體積，均勻混合1ml SOD提取液、0.3ml NBT顯色液、0.3ml酶溶液，即可配置成1.6ml NBT酶工作液，根據(jù)待檢測樣品(包括標(biāo)準(zhǔn)品)的數(shù)量，配置適量的NBT酶工作液。具體配置方法可以參考下表，配制好的NBT酶工作液4℃或冰浴保存，可以在當(dāng)天使用，但建議盡量現(xiàn)配現(xiàn)用。注意：由于酶溶液的用量較少且易沉降，必須注意在使用前先輕輕離心一下，然后適當(dāng)混勻后再使用。
3、 (選做)準(zhǔn)備SOD標(biāo)準(zhǔn)品：需自備SOD標(biāo)準(zhǔn)品，用本試劑盒提供的SOD提取液將SOD標(biāo)準(zhǔn)品稀釋至如下系列濃度：200、100、50、20、10、5、2U/ml，各取20μl參考樣品進(jìn)行檢測。注意：為避免稀釋后SOD酶活性的下降， SOD標(biāo)準(zhǔn)品宜現(xiàn)稀釋現(xiàn)使用，該試劑盒對于SOD的檢測并不需要SOD作為標(biāo)準(zhǔn)品，但可使用SOD標(biāo)準(zhǔn)品作為陽性對照或作為對SOD活性定量的參考。
4、 SOD加樣：參考下表使用小離心管或試管設(shè)置空白對照管、光照對照管、測定管。并按下表依次加入待測樣品和其它各種溶液，加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后充分混勻。注意：加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液后反應(yīng)即會開始，可以在低溫操作或用排槍操作以減小各孔間因加入反應(yīng)啟動(dòng)工作液的時(shí)間先后差異而導(dǎo)致的誤差。
| 加入物(ml) | 空白對照管 | 光照對照管 | 測定管 |
| SOD提取液 | 0.2 | 0.2 | — |
| 待測樣品(上清液) | — | — | 0.2 |
| NBT酶工作液 | 1.6 | 1.6 | 1.6 |
| 反應(yīng)啟動(dòng)液 | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
5、 SOD測定：混勻，取空白對照管置于暗處，其他各管置于4000Lx日光下反應(yīng)20min，各管受光情況應(yīng)一致，溫度高時(shí)時(shí)間縮短，低時(shí)延長；反應(yīng)結(jié)束后以不照光的空白對照管調(diào)零，用分光光度計(jì)或酶標(biāo)儀測定560nm處吸光度，如果用分光光度計(jì)，比色杯光徑1cm，加入的上清量因根據(jù)比色杯的最小量程而定。
五、計(jì)算結(jié)果：
SOD活力單位定義：以抑制NBT光化還原的50%為一個(gè)酶活性單位(U)。
液體中總SOD活力(U/ml)=(A光照－A測定)/(50%×A光照×VT)
組織、細(xì)胞勻漿液中總SOD活力(U/g)=(A光照－A測定)×V/(50%×A光照×VT×W)
血液中總SOD活力(U/gHb)=(A光照－A測定)×V×C/(50%×A光照×VT×Hb)
式中：A光照=光照對照管的吸光度
A測定=測定管的吸光度
V=樣品液總體積(ml)
VT=測定時(shí)樣品所用體積(ml)
W=樣品鮮質(zhì)量(g)
C=1ml/采血量(ml)
Hb=血紅蛋白含量(gHb/ml)
六、注意事項(xiàng):
1、 上述低溫試劑避免反復(fù)凍融，以免失效或效率下降。
2、 待測樣品-70℃可保存1個(gè)月，需注意反復(fù)凍融會導(dǎo)致SOD部分失活。
3、 細(xì)胞或組織等樣品制備時(shí)不能采用含有Triton X-100等去垢劑的溶液，否則會干擾本試劑盒的檢測。
4、 抗氧化物會對本試劑盒的檢測產(chǎn)生干擾，例如0.1mM ascorbic acid，5mM GSH都會使測定出來的吸光度顯著升高。
5、 對于植物樣品，研磨處理應(yīng)迅速，以免SOD酶活下降，盡量處于冰浴狀態(tài)處理。
6、 如果無4000Lx日光，可200W在10~12cm處垂直照射20min；在超凈工作臺5cm垂直照射30min左右；在強(qiáng)太陽光下垂直照射30min左右。
7、 一般要求各管受光情況一致，所有反應(yīng)管應(yīng)排列在與日光燈管平行的直線上。
8、 反應(yīng)溫度控制在25℃，視酶活性高低適當(dāng)調(diào)整反應(yīng)時(shí)間；溫度較高時(shí)，光照時(shí)間應(yīng)縮短；溫度較低時(shí)，光照時(shí)間相應(yīng)延長。
9、 所用離心管或試管應(yīng)潔凈透明，透光性好。
10、 如果配制的NBT酶工作液出現(xiàn)淡黃色沉淀或絮狀物應(yīng)棄用，否則效果不佳。
11、 如果用酶標(biāo)儀，96孔板每孔應(yīng)加20μl上清液，相應(yīng)檢測的次數(shù)大大增加。
12、 為了您的安全和健康，請穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
