pCMV-Cre-mCherry是自行研發(fā)的含有CMV啟動(dòng)子的用于在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中表達(dá)帶有mCherry (DsRed的突變體，一種非常明亮的紅色熒光蛋白)標(biāo)簽的Cre Recombinase (Cre重組酶)的表達(dá)質(zhì)粒。來(lái)自條件性基因敲除(conditional knockout) 小鼠等含有預(yù)先插入loxP位點(diǎn)的細(xì)胞在轉(zhuǎn)染本質(zhì)粒后，本質(zhì)粒表達(dá)的Cre Recombinase可以導(dǎo)致兩個(gè)loxP位點(diǎn)間的基因刪除，從而實(shí)現(xiàn)條件性基因敲除(conditional gene knockout)。
Cre重組酶是來(lái)源于大腸桿菌噬菌體P1的一種類型I的拓樸異構(gòu)酶(Type I topoisomerase)，也是一種酪氨酸重組酶(tyrosine recombinase)，它可識(shí)別34bp的loxP位點(diǎn)(兩端為兩個(gè)13bp的反向重復(fù)序列(inverted repeats)，中間是8bp的間隔區(qū)(圖1)并催化loxP位點(diǎn)之間的DNA發(fā)生重組；重組產(chǎn)物根據(jù)loxP位點(diǎn)的位置和相對(duì)方向的不同而不同，兩個(gè)含單loxP位點(diǎn)的DNA將發(fā)生融合：兩個(gè)正向重復(fù)的loxP位點(diǎn)間的DNA將以環(huán)狀形式被切割，而兩個(gè)反向loxP位點(diǎn)間的DNA序列將被翻轉(zhuǎn)(圖2)。
圖2. Cre-loxP位點(diǎn)特異性重組示意圖。
pCMV-Cre-mCherry質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后的熒光表達(dá)效果，可以看到mCherry標(biāo)簽的Cre重組酶主要分布在細(xì)胞核中(圖3)。
圖3. pCMV-Cre-mCherry質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞后的表達(dá)效果圖。左圖為明場(chǎng)照片，中圖為熒光照片，右圖為疊加照片。
本質(zhì)粒為卡那霉素抗性，轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，可使用G418篩選穩(wěn)定表達(dá)目的蛋白的細(xì)胞株。
pCMV-Cre-mCherry質(zhì)粒的主要信息如下：
| Feature Nucleotide | Position |
| CMV promoter | 1-602 |
| T3 promoter and T3 primer binding site | 620-639 |
| Cre recombinase | 677-1705 |
| mCherry | 1718-2428 |
| multiple cloning site | 2340-2488 |
| T7 promoter and T7 primer binding site | 2532-2553 |
| SV40 polyA signal | 2565-2948 |
| f1 origin of ss-DNA replication | 3086-3390 |
| bla promoter | 3415-3539 |
| SV40 promoter | 3559-3897 |
| neomycin/kanamycin resistance ORF | 3932-4723 |
| HSV-thymidine kinase (TK) polyA signal | 4724-5182 |
| pUC origin | 5311-5978 |
pCMV-Cre-mCherry質(zhì)粒(6030bp)的圖譜如下：
pCMV-Cre-mCherry中沒(méi)有的酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that do not cut pCMV-Cre-mCherry)包括：
| AflII | AscI | BaeI | BlpI | BmgBI | BsiWI | BspEI |
| BspQI | BstXI | BstZ17I | EarI | EcoNI | FseI | NotI |
| PmeI | PmlI | PpuMI | PspXI | SacII | SapI | ScaI |
| SmaI | SrfI | SwaI | TspMI | XmaI |
pCMV-Cre-mCherry中的單酶切位點(diǎn)(Restriction enzymes that cut pCMV-Cre-mCherry)包括：
| AccI | GT`MK,AC | 2454 | Esp3I | CGTCTCN`NNNN, | 1360 |
| AclI | AA`CG,TT | 1047 | HindIII | A`AGCT,T | 2430 |
| AfeI | AGC|GCT | 660 | HpaI | GTT|AAC | 2825 |
| AhdI | GACNN,N`NNGTC | 1911 | MfeI | C`AATT,G | 2812 |
| AleI | CACNN|NNGTG | 2360 | MluI | A`CGCG,T | 2948 |
| ApaI | G,GGCC`C | 2488 | NdeI | CA`TA,TG | 240 |
| AsiSI | GCG,AT`CGC | 1133 | NheI | G`CTAG,C | 597 |
| BamHI | G`GATC,C | 1032 | NruI | TCG|CGA | 891 |
| BbsI | GAAGACNN`NNNN, | 2153 | PaeR7I | C`TCGA,G | 2465 |
| BbvCI | CC`TCA,GC | 2256 | PaqCI | CACCTGCNNNN`NNNN, | 1286 |
| BcgI | ,NN`(N)10CGA(N)6TGC(N)10,NN` | 1079 | PflFI | GACN`N,NGTC | 4178 |
| BclI | T`GATC,A | 2719 | PflMI | CCAN,NNN`NTGG | 2154 |
| BglII | A`GATC,T | 2460 | PshAI | GACNN|NNGTC | 1512 |
| BmtI | G,CTAG`C | 597 | PspOMI | G`GGCC,C | 2483 |
| BsaI | GGTCTCN`NNNN, | 5049 | SacI | G,AGCT`C | 651 |
| BsgI | GTGCAG(N)14,NN` | 2310 | SalI | G`TCGA,C | 2454 |
| BsmBI | CGTCTCN`NNNN, | 1360 | SbfI | CC,TGCA`GG | 2069 |
| BsrGI | T`GTAC,A | 2418 | SfiI | GGCCN,NNN`NGGCC | 3832 |
| BssHII | G`CGCG,C | 918 | SgrAI | CR`CCGG,YG | 2399 |
| BtsI | GCAGTG,NN` | 2899 | SpeI | A`CTAG,T | 2478 |
| CspCI | ,NN`(N)11CAA(N)5GTGG(N)10,NN` | 380 | Tth111I | GACN`N,NGTC | 4178 |
| DraIII | CAC,NNN`GTG | 3175 | XbaI | T`CTAG,A | 2472 |
| EagI | C`GGCC,G | 3966 | XcmI | CCANNNN,N`NNNNTGG | 2403 |
| Eco53I | GAG|CTC | 653 | XhoI | C`TCGA,G | 2466 |
| EcoRI | G`AATT,C | 2442 | XmnI | GAANN|NNTTC | 885 |
如需對(duì)pCMV-Cre-mCherry質(zhì)粒中插入片段Cre-mCherry進(jìn)行測(cè)序時(shí)，推薦使用的正向測(cè)序引物T3和反向測(cè)序引物T7的序列如下：
T3 primer (620-639): 5' AATTAACCCTCACTAAAGGG 3'
T7 primer (2532-2553): 5' GTAATACGACTCACTATAGGGC 3'
包裝清單：| 產(chǎn)品編號(hào) | 產(chǎn)品名稱 | 包裝 |
| D2607-1µg | pCMV-Cre-mCherry | 1μg |
| D2607-100µg | pCMV-Cre-mCherry | 100μg |
| — | 說(shuō)明書 | 1份 |
-20℃保存。
注意事項(xiàng)：本質(zhì)粒未經(jīng)書面許可不得用于任何商業(yè)用途，也不得移交給訂貨人所在實(shí)驗(yàn)室外的任何個(gè)人或單位。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請(qǐng)穿實(shí)驗(yàn)服并戴一次性手套操作。
使用說(shuō)明：
1.首次使用1µg包裝的本產(chǎn)品時(shí)，請(qǐng)先取少量本質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌，進(jìn)行質(zhì)粒小量、中量或大量抽提后再用于后續(xù)用途。抽提獲得的質(zhì)粒可以通過(guò)酶切電泳進(jìn)行鑒定，或通過(guò)測(cè)序進(jìn)行鑒定。
2.100µg包裝的本產(chǎn)品質(zhì)粒濃度為0.1µg/µl，共1ml�？梢灾苯佑糜诿盖谢蛘咿D(zhuǎn)染細(xì)胞。
