產(chǎn)品及特點
本試劑盒可用于檢測食品或其他材料中是否有鱷魚的成分,F(xiàn)代食品加工工藝極大改變了食材原有的味道、氣味、色澤、紋理和質(zhì)地等特性,因此傳統(tǒng)的感官鑒別技術(shù)已經(jīng)無法對食材的真?zhèn)芜M行準確的鑒定。同時部分食材還有致敏性,因此基于基因檢測的快速靈敏的食材來源檢測技術(shù)將對食品監(jiān)管和安全提供重要的保障。本產(chǎn)品就是為滿足這一需求根據(jù)探針法qPCR原理開發(fā)的產(chǎn)品,它具有下列特點:
1.即開即用,用戶只需要提供樣品DNA模板。
2.根據(jù)鱷魚DNA保守區(qū)域設(shè)計引物和探針,能專一性地檢測出樣品中的鱷魚成分,但不能檢測其他非鱷魚成分。
3.提供陽性對照,便于區(qū)分假陰性樣品。
4.一管式閉管操作,降低了交叉污染。
5.快速,整個檢測過程(按一個樣品計)所需時間僅為2.0小時。
6.對混合樣品中鱷魚成分的檢測下限為0.01%,對樣品中鱷魚成分的核酸檢測下限為0.1ng/µL。
7.本產(chǎn)品既可以定性,又可以定量。定量時其線性范圍至少有5個數(shù)量級。
8.本只能用于科研,足夠50次20uL體系的熒光定量PCR。
規(guī)格及成分
2×Probe qPCR MagicMix90408500uL(本色蓋)
熒光PCR專用模板稀釋液1807011mL(紅蓋)
鱷魚源性成分探針法qPCR
引物探針混合液 yp15-169150uL(棕色管)
鱷魚源性成分探針法qPCR
陽性對照(1×10E7拷貝/uL)pd16950uL(黃蓋)
自備試劑:DNA模板
使用方法:
一、稀釋標準曲線樣品(以10E1-10E6拷貝/μL這6個10倍稀釋度為例)。由于標準品濃度非常高,因此下列稀釋操作一定要在獨立的區(qū)域進行,千萬不能污染樣品或本試劑盒的其他成分)。
1.標記6個離心管,分別為6,5,4,3,2,1。
2.用帶芯槍頭分別加入45μL熒光PCR專用模板稀釋液,最好用帶芯槍頭,下同)。
3.在6號管中加入5μL陽性對照(濃度為1×10E7拷貝/μL,試劑盒提供),充分震蕩1分鐘,得1×10E6拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭,在5號管中加入5μL 1×10E6拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E5拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
5.換槍頭,在4號管中加入5μL 1×10E5拷貝/μL 的陽性對照(上步稀釋所得),充分震蕩1分鐘,得1×10E4拷貝/μL的標準曲線樣品。放冰上待用。
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個稀釋度的標準曲線樣品。放冰上待用。
二、樣品DNA的制備
7.如果有N個樣品,最好設(shè)置N+2個提取,多出的一個是PC(樣品制備陽性對照),一個是NC(樣品制備陰性對照)?梢杂10μL 第4號稀釋液(第6步所得)再加上一定量的水使總體積跟每次制備要求的體積一樣,以此作為樣本制備PC。另外用水作為樣本制備NC。
8.用自選方法純化樣品的DNA,本擴增試劑盒跟市場上大多數(shù)細菌DNA提取試劑盒兼容。
三、設(shè)置qPCR反應(yīng)(20μL體系,在樣品制備室進行)
9.如果做定量分析并且只做1次重復(fù),則標記N+9個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),6個用于標準曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù),則標記N+4個PCR管,其中N+2個用于上步得到的N+2個樣品,1個用于PCR陰性對照(用水做模板),1個用于PCR陽性對照(可直接用第6步所得的第4號稀釋液)。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
在標記管中按下表加入各成分(本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽性對照,并且陽性對照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲存好后最后加)
四:略
五、數(shù)據(jù)處理
11.如果把本試劑盒用于定量檢測,則以陽性對照濃度的log值為橫軸,以Ct值為縱軸,繪制標準曲線。再以待測樣品的Ct值從標準曲線上推算出樣品DNA濃度的log值,再推算出其濃度。
如果把本試劑盒用于定性檢測,只判斷陽性或陰性,則陰性對照Ct必須大于或等于40。陽性對照必須有熒光對數(shù)增長,有典型擴增曲線,Ct值應(yīng)該小于或等于35。對待測樣品,如果其Ct大于或等于40則為陰性,如果小于或等于35則為陽性。如果在35-40之間,則重復(fù)一次。重復(fù)實驗的Ct值如果大于或等于40則為陰性,如果小于40,則為陽性。
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