| 產(chǎn)品及特點(diǎn) | 本試劑盒是基于沙門氏噬菌體T3 RNA 聚合酶的 RNA 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒，它利用含有 T3 啟動子的模版DNA，以 NTP 為底物，從 T3 啟動子下游開始合成與模板 DNA 中一條鏈互補(bǔ)的RNA，簡單快速獲得大量的 RNA 分子。本產(chǎn)品具有下列特點(diǎn)： 1. 即開即用，用戶只需提供含 T3 啟動子的 DNA 模板即可以進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄實(shí)驗(yàn)，不需單獨(dú)準(zhǔn)備每一個(gè)成份。 2. 單溶液預(yù)配液，減少加樣次數(shù)，避免了操作誤差，增加了可重復(fù)性。 3. 模板 DNA 可以是線性化的質(zhì)粒 DNA，也可以是 PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物。 4. 可以合成的 RNA 的最佳長度在 20 nt 到 5000 nt 之問。 5. 產(chǎn)品配方經(jīng)過精心優(yōu)化，每μg DNA 模板可以合成 2-6 μg RNA。 6. 得到的 RNA 可以用于 RNA 結(jié)構(gòu)研究、核解生物化學(xué)、體外翻譯、RNA- 蛋白質(zhì)相互作用、反義技術(shù)、SELEX 技術(shù)和 RNA 干擾（RNAi）等實(shí)驗(yàn)。 | ||||
| 規(guī)格及成分 |
| 成份 | 編號 | 十孔盒包裝 |
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| 2×T3 轉(zhuǎn)錄預(yù)配液 | 91108a | 0.5 mL（本色蓋） | |||
| T3 RNA 聚合酶混合液 | 120309 | 50 μL（紅色蓋） | |||
| RNase-free 水 | 80403 | 1 mL（亮黃蓋） | |||
| 使用手冊 | 91108sc | 1 份 | |||
| 運(yùn)輸及保存 | 低溫運(yùn)輸，-20℃保存, 有效期一年。 | ||||
| 自備試劑 | 如果需要去除轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物中的DNA 模板，則需要RNase-free DNase 、Tris 飽 和酚、氯仿、微量核酸沉淀劑、RNase-free 75%乙醇（均可從本公司另購） | ||||
| 使用方法 | 一、制備 DNA 模板 PCR 片段和質(zhì)粒 DNA 都可以用作體外轉(zhuǎn)錄的模板，但是必須注意以下幾點(diǎn)。一是必須使用線性化的 DNA。如果是質(zhì)粒 DNA，則必須先用適當(dāng)?shù)?/span>限制性內(nèi)切酶切成線狀。二是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的上游必須有 T3 啟動子。如果模板是 PCR 產(chǎn)物，則可以在設(shè)計(jì)引物時(shí)將 T3 啟動子序列 （5’AATTAACCCTCACTAAAGG 3’）加上。如果是將 DNA 片段克隆到載體上，則需要選擇有 T3 啟動子的載體，并且克隆位點(diǎn)必須位于 T3 啟動子下游。三是需要轉(zhuǎn)錄的 DNA 序列的下游端最好不要是 3’突出。如果是 3’突出（如選擇了Pst I 來線性化質(zhì)粒），則最好用 T4 DNA 聚合酶修 平。四是必須保證 DNA 模板中沒有 RNase。由于提取質(zhì)粒 DNA 的過程中 | ||||
一般要使用大量的RNase A，因此質(zhì)粒 DNA 一般都有嚴(yán)重的 RNase A 污染，所以在用作模板前，最好采取膠回收得方法回收質(zhì)粒 DNA。并且加入少量總 RNA 一起保溫，然后電泳檢測 RNA 是否被降解，以此判斷純化的DNA 模板是否有殘留RNase A。
二、體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)
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| 但所用試劑需另行購買，本試劑盒不提供。 1.在體外轉(zhuǎn)錄結(jié)束后，在反應(yīng)體系中加入 3-5 U 自備的 RNase-free DNase。 2.37℃保溫 15-30 分鐘。 3. 補(bǔ)水到 100 μL， 4. 用自備的等體積（100 μL）的Tris 飽和酚-氯仿抽提一次去除殘留的DNase 和 RNA 聚合酶。 5. 在上清中加 200 μL 自備的微量核酸沉淀劑（CAT#50903；用前需要搖晃混勻），振蕩后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。 6. 加入 1 mL 75%乙醇，震蕩 10 秒后 15000 rpm 離心 3-5 分鐘，棄上清。 7. 短暫離心數(shù)秒，用槍頭吸棄上清。 8. 晾干半分鐘，所得沉淀即去除 DNA 模板后的 RNA。可溶于 RNase-free 水中后立即使用或放-80℃長期保存。 |
| 答客問 | 1、沒有 RNA 產(chǎn)物。最常見原因是 DNA 模板有 RNase 污染，測試方法是將純化的有兩條典型 RNA 條帶的總 RNA 跟模板 DNA 一起保溫，再檢測 RNA 是否降解。本試劑盒緩沖液和酶混合液中有 RNase inhibitor，如果模板 RNase 污染嚴(yán)重，可能需要用戶補(bǔ)加 RNase inhibitor。 2、RNA 產(chǎn)量低。最常見的原因是 DNA 模板序列。在轉(zhuǎn)錄序列的第一個(gè)和第二個(gè)堿基最好都是G，在前 14 個(gè)堿基內(nèi)避免有U 存在。 3、RNA 長度比預(yù)期的短�？赡苁悄０逍蛄兄杏�T3 RNA 聚合酶的終止序列。可以改用 SP6 或 T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（啟動子也必須做相應(yīng)的改變）。 4、RNA 長度比預(yù)計(jì)的長。T3 RNA 聚合酶跟Taq DNA 聚合酶一樣，有不依賴于模板的加尾功能，最多有一半的 RNA 可以帶一個(gè)或兩個(gè)堿基的尾巴。如果 RNA 長度比預(yù)計(jì)的長很多，使用的模板又是質(zhì)粒 DNA，則可能是質(zhì)粒DNA 線性化不徹底。 5、5’單磷酸還是三磷酸。如果使用 GTP，則得到的 RNA 是三磷酸，體外轉(zhuǎn)錄時(shí)如果保溫時(shí)間太長（如 12 小時(shí)），則有 50%的三磷酸會變成單磷酸。如果在轉(zhuǎn)錄體系中加入 GMP，則 T3 RNA 聚合酶將優(yōu)先使用 GMP，所得RNA 產(chǎn)物中 5’端是單磷酸的比例將大大增加。 6、如何得到帶帽 RNA？需加入帶帽 NTP 類似物即可，NEB 提供 5 種供選擇。 |
| 關(guān)聯(lián)產(chǎn)品 | T7 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（CAT#:91106）、SP6 體外轉(zhuǎn)錄試劑盒（CAT#:91107） |
