產(chǎn)品及特點(diǎn)
人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒2型（HumanT-lymphotropicVirus2,HTLV-2）是一種感染后可導(dǎo)致血癌或其他轉(zhuǎn)移癌的RNA病毒，HTLV-2和HTLV-1同源性達(dá)到70%，也是艾滋病毒(HIV-I)的遠(yuǎn)親。該病毒在體內(nèi)主要感染CD4+T淋巴細(xì)胞，可引起成人T淋巴細(xì)胞白血病/淋巴瘤等疾病，主要通過輸血、針頭、性行為、母子傳染，對(duì)人類健康構(gòu)成威脅，因此快速靈敏檢測(cè)HTLV病毒具有重要意義。本產(chǎn)品就是以探針法熒光定量RT-PCR技術(shù)為基礎(chǔ)開發(fā)的專門檢測(cè)人類嗜T淋巴細(xì)胞病毒2型的試劑盒，它具有下列特點(diǎn)：
1.即開即用，用戶只需要提供樣品RNA模板。
2.引物和探針經(jīng)過優(yōu)化，分析靈敏性高。
3.提供陽(yáng)性對(duì)照，便于區(qū)分假陰性樣品。
4.特異性高，引物是根據(jù)HTLV病毒2型高度保守區(qū)設(shè)計(jì)，不會(huì)跟其他病毒的RNA發(fā)生交叉反應(yīng)。
5.既可用于定性檢測(cè)，又可用于定量檢測(cè)。用于定量檢測(cè)時(shí)線性范圍至少為5個(gè)數(shù)量級(jí)。
6.本產(chǎn)品足夠50次 20μL體系的探針法熒光定量RT-PCR反應(yīng)。
7.本產(chǎn)品只能用于科研。
| 成分 | 編號(hào) | 五孔盒包裝 |
| 探針法qRT-PCR緩沖液 | 190504a | 500μL（白蓋） |
| 探針法qRT-PCR酶混合液 | 190504b | 100μL（紅蓋） |
| 熒光PCR專用模板稀釋液 | 180701 | 1mL（綠蓋） |
| HTLV病毒2型探針法qRT-PCR 引物-探針混合液 | 15-87820yp | 150μL（棕色管） |
| HTLV病毒2型探針法qRT-PCR 陽(yáng)性對(duì)照(1×10E7拷貝/μL) | 87820pc | 50μL（黃蓋） |
運(yùn)輸及保存 低溫運(yùn)輸，-20℃保存，保存期限為12個(gè)月。
自備試劑樣品RNA，超純水。
使用方法
一、稀釋標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品（以10E1-10E6拷貝/μL這6個(gè)10倍稀釋度為例）。由于標(biāo)準(zhǔn)品濃度非常高，因此下列稀釋操作一定要在獨(dú)立的區(qū)域進(jìn)行，千萬(wàn)不能污染樣品或本試劑盒的其他成分。為增加產(chǎn)品穩(wěn)定性和避免擴(kuò)散傳染性病原，本產(chǎn)品不提供活體樣品做陽(yáng)性對(duì)照，只提供無(wú)傳染性的DNA片段作為陽(yáng)性對(duì)照。
1.標(biāo)記6個(gè)離心管，分別為 6，5，4，3，2，1。
2.用帶芯槍頭分別加入45μL熒光RT-PCR專用模板稀釋液，最好用帶芯槍頭，下同。
3.在6號(hào)管中加入5μL1×10E7拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(試劑盒提供)，充分震蕩1分鐘，得1×10E6拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。
4.換槍頭，在5號(hào)管中加入5μL1×10E6拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E5拷貝/μL 的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品 。放冰上待用
5.換槍頭，在4號(hào)管中加入5μL1×10E5拷貝/μL的陽(yáng)性對(duì)照(上步稀釋所得)，充分震蕩1分鐘，得 1×10E4拷貝/μL的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。 放冰上待用
6.重復(fù)上面的操作直到得到6個(gè)稀釋度的標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品。放冰上待用。二、樣品RNA的制備
7.如果有N個(gè)樣品，最好設(shè)置N+2個(gè)提取，多出的是PC（樣品制備陽(yáng)性對(duì)照）和NC（樣品制備陰性對(duì)照）�？梢匀￡�(yáng)性對(duì)照的1000倍稀釋液10μL再加上一定量的水，使總體積與待提取樣品的規(guī)定體積一致，以此作為PC另外用水作為NC。
8.用自選方法純化樣品的RNA，本試劑盒跟市場(chǎng)上大多數(shù)病毒RNA提取試劑盒兼容。也可以選購(gòu)本公司的柱式病毒RNAout或免提取核酸釋放劑。
三、ProbeqRT-PCR反應(yīng)（20μL體系，在樣品制備室進(jìn)行）
9.如果做定量分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+9個(gè)RT-PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰性對(duì)照（用水做模板）6個(gè)用于標(biāo)準(zhǔn)曲線。如果做定性分析并且只做1次重復(fù)，則標(biāo)記N+4個(gè) RT-PCR管，其中N+2個(gè)用于上步得到的N+2個(gè)樣品，1個(gè)用于RT-PCR陰 性對(duì)照（用水做模板），1個(gè)用于RT-PCR陽(yáng)性對(duì)照（用第4號(hào)管的陽(yáng)性對(duì)照稀釋液做模板）。下面只以定量分析為例描述操作步驟。
10.在標(biāo)記管中按下表加入各成分（本表只列出一次重復(fù)。樣品管和陰性對(duì)照設(shè)置完畢后才設(shè)置陽(yáng)性對(duì)照，并且陽(yáng)性對(duì)照樣品要等所有管子蓋上蓋子儲(chǔ)存好后最后加）：
| 成分/每管 | 樣品管 N+2個(gè) | RT-PCR 陰性對(duì)照 | 標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品管 （1-6管） |
| 探針法qRT-PCR緩沖液 | 10μL | 10μL | 10μL |
| 探針法qRT-PCR酶混合液 | 2μL | 2μL | 2μL |
| HTLV病毒2型探針法qRT- PCR引物-探針混合液 | 3μL | 3μL | 3μL |
| N+2個(gè)待測(cè)RNA樣本 | 5μL | 不加 | 不加 |
| 自備超純水 | 不加 | 5μL | 不加 |
| 第 6步所得標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品稀釋液 （1-6號(hào)） |
不加 |
不加 | 5μL（1號(hào)樣到 1號(hào)管，2號(hào)樣 到2號(hào)管…） |
11.蓋上蓋子后上機(jī)，按下面參數(shù)進(jìn)行RT-PCR：
| 過程 | 溫度 | 時(shí)間 |
| 逆轉(zhuǎn)錄 | 50℃ | 20min |
| 預(yù)變性 | 94℃ | 10min |
| RT-PCR反應(yīng) （45個(gè)循環(huán)） | 94℃ | 30sec |
|
| 58℃ | 1min（采集FAM通道的熒光信號(hào)） |
五、數(shù)據(jù)處理
12.如果把本試劑盒用于定量檢測(cè)，則以陽(yáng)性對(duì)照濃度的log值為橫軸，以Ct值為縱軸，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。再以待測(cè)樣品的Ct值從標(biāo)準(zhǔn)曲線上推算出樣品RNA濃度的log值，再推算出其濃度。如果把本試劑盒用于定性檢測(cè)，只判斷陽(yáng)性或陰性，則陰性對(duì)照Ct必須大于或等于40。陽(yáng)性對(duì)照必須有熒光對(duì)數(shù)增長(zhǎng)，有典型擴(kuò)增曲線，Ct值應(yīng)該小于或等于38。對(duì)待測(cè)樣品，如果其Ct大于或等于40則為陰性，如果小于或等于38則為陽(yáng)性。如果在38-40之間，則重復(fù)一次。重復(fù)實(shí)驗(yàn)的Ct值如果大于或等于40則為陰性，如果小于40，則為陽(yáng)性。
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