Calcein-AM/PI 活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑盒說明書
貨號：YS1630M
規(guī)格：500T
保存：-20°C 避光干燥保存，一年有效。
產(chǎn)品內(nèi)容：
| 名稱 | 規(guī)格 | 保存 |
| Calcein-AM Solution(2mM) | 50μL | -20°C 避光干燥保存 |
| PI Solution (1.5 mM) | 150μL | -20°C 避光干燥保存 |
| 10×Assay Buffer | 50mL | -20℃保存，經(jīng)常使用可放在 4℃保存。 |
產(chǎn)品說明：
Calcein-AM 是 一種對 活細(xì) 胞進(jìn) 行 熒光 標(biāo)記 的細(xì) 胞 染色試劑 ， 發(fā) 綠色 熒 光 ( Ex=490nm, Em=515nm) 。因其在傳統(tǒng)的 Calcein (鈣黃綠素) 基礎(chǔ)上引入乙酰甲氧基甲酯 (AM) 基團(tuán)，增加了 疏水性，使其能夠輕易穿透活細(xì)胞膜。一旦進(jìn)入細(xì)胞后，Calcein-AM (本身不發(fā)熒光) 被細(xì)胞內(nèi)的 酯酶剪切形成膜非滲透性的極性分子 Calcein，從而被滯留在細(xì)胞內(nèi)并發(fā)出強(qiáng)綠色熒光。與其它同類 試劑 (如 BCECF-AM 和 CFDA)相比，由于 Calcein, AM 細(xì)胞毒性極低，是最適合用于活細(xì)胞染色的 熒光探針，而且不會抑制任何的細(xì)胞功能，如增殖和淋巴球的趨化性。
由于死細(xì)胞缺乏酯酶，Calcein-AM 僅用于對活細(xì)胞的細(xì)胞生存能力測試和短期標(biāo)記。因此， Calcein-AM 常常與死細(xì)胞熒光探針如碘化丙啶 (PI) 等聯(lián)合使用，同時進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的熒光 雙重染色。碘化丙啶 (Propidium iodide ，PI) 不能穿過活細(xì)胞的細(xì)胞膜，僅能穿過死細(xì)胞膜的無序 區(qū)域而到達(dá)細(xì)胞核，并嵌入細(xì)胞的 DNA 雙螺旋從而產(chǎn)生紅色熒光 (Ex=535 nm, Em=617 nm)，因此 PI 僅對死細(xì)胞染色。由于 Calcein 和 PI-DNA 都可被 490 nm激發(fā)，因此可用熒光顯微鏡同時觀察活 細(xì)胞和死細(xì)胞。而用 545 nm 激發(fā)，僅可觀察到死細(xì)胞。
本試劑盒的工作原理就在于 Calcein-AM 和 PI 的雙重染料，來進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞的雙重染色 標(biāo)記，從而進(jìn)行活細(xì)胞和死細(xì)胞水平的分析。根據(jù)我司優(yōu)化的實驗體系，單次就 200µL 細(xì)胞懸液進(jìn) 行染色，可以做 500 次檢測。
使用方法 (僅供參考)：
1. 工作液的前處理
( 1) 從低溫冰箱內(nèi)取出 10×Assay Buffer，根據(jù)單次用量無菌條件取出適量，用去離子水 10 倍稀釋 以得到 1×Assay Buffer。
(2) 由于 Calcein-AM 的穩(wěn)定性受溫度影響較大，建議收到貨后，可分裝為小份，密封避光保存于 -20℃ ，不能反復(fù)凍融。若染色液經(jīng)稀釋，建議當(dāng)天用完。
2. 細(xì)胞處理
( 1) 懸浮生長的細(xì)胞，收集至離心管，450g ，離心 5min ，去除上清。用 1x 的 Assay Buffer 洗滌 細(xì)胞，450g ，離心 5min ，2 次，去除殘留酯酶。
(2) 貼壁細(xì)胞經(jīng) 0.25%胰酶-EDTA 消化后，收集細(xì)胞，用 1x 的 Assay Buffer 洗滌細(xì)胞，450g ，離 心 5min ，2 次，去除胰酶及殘留的酯酶。
3. 染色步驟
( 1) 離心得到的細(xì)胞沉淀用 1×Assay Buffer 重懸，使重懸后細(xì)胞懸液計數(shù)細(xì)胞量為 1×105~6 個/ml。
(2) 每 1ml 的細(xì)胞量加入 1-2ul 的 Calcein-AM (原液)，吹打混勻，37℃避光孵育 20min-25min。
(3) 將試劑盒自帶的 PI 原液取 3-5ul 加入上述染色細(xì)胞中，室溫避光染色 5min。
(4) 孵育熒光后的細(xì)胞，450g ，5min ，離心去除染色液。 注：細(xì)胞進(jìn)行熒光染色時建議全程避光。
(5) 用 1x 的 PBS 清洗細(xì)胞 450g ，5min ，離心后用 1x PBS 重懸細(xì)胞，取 3-5ul 滴在潔凈的載玻片 上，用干凈的蓋玻片壓片后，請及時熒光鏡檢。
(6) 熒光顯微鏡下使用 490± 10 nm 激發(fā)濾片同時檢測活細(xì)胞 (黃綠色熒光) 以及死細(xì)胞 (紅色熒 光)。另外，使用 545nm 的發(fā)射濾片僅能觀察到死細(xì)胞。也可以直接在熒光酶標(biāo)儀下使用合適 的濾片進(jìn)行檢測。
注意事項：
( 1) 為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
(2) 貼壁細(xì)胞也可以不消化，直接去除培養(yǎng)基，經(jīng) 1×Assay Buffer 浸洗 2min ，2 次。按上述細(xì)胞量 和染色液濃度比例進(jìn)行染色，染色時間和染色液工作濃度可按實際檢測調(diào)整。
(3) Calcein-AM 作用于細(xì)胞，一般細(xì)胞量在 1×105-6 個時，Calcein-AM 的工作濃度基本在 1-2µM； PI 的工作濃度在 5µM 。但由于不同細(xì)胞系的最佳染色條件不同，初次實驗建議做梯度實驗，以 確定 Calcein-AM 和 PI 的最適濃度。梯度篩選的原則為使用最低的探針濃度得到最好的熒光結(jié) 果。
(4) 碘化丙啶 (PI) 有一定的致癌性，操作時一定要注意防護(hù)。若接觸到皮膚，需要立即用自來水 清洗。
注：可以使用以下方法來優(yōu)化得到兩種熒光染料針對不同細(xì)胞的最佳工作濃度。
a) 用 0. 1%皂素或者 0. 1-0.5%地高辛孵育細(xì)胞 10min ，或者用 70%乙醇孵育細(xì)胞 30min ，從而制 備死細(xì)胞；
b) 用 0. 1- 10µM 的 PI 溶液進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到僅僅對細(xì)胞核染色，而不會對細(xì)胞質(zhì)染色的 最佳工作濃度。
c) 用 0. 1- 10µM 的 Calcein-AM 進(jìn)行死細(xì)胞染色，以得到不會對細(xì)胞質(zhì)染色的最佳工作濃度。然 后用此濃度進(jìn)行活細(xì)胞染色，去觀察是否活細(xì)胞能被染色。
