注 意：正式測定之前選擇2-3個預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
AsA作為植物細胞一個重要生理指標，其AsA 的含量、氧化還原狀態(tài)(AsA/DHA 比率)及其合成與代謝相關(guān)酶類活性的變化涉及植物對一系列環(huán)境脅迫的響應(yīng)。DHA是AsA的可逆的氧化型，在生物體內(nèi)，與抗壞血酸共同組成氧化還原系統(tǒng)，具有電子受體的作用。
測定原理：
DTT還原DHA生成AsA，通過測定體系中AsA的生成速率，即可計算出DHA含量。
自備儀器和用品：
低溫離心機、紫外分光光度計、1mL石英比色皿、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。
試劑組成和配制：
試劑一：液體50 mL×1瓶，室溫保存。
試劑二：液體40 mL×1瓶，室溫保存。
試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加入10mL蒸餾水充分溶解。
標準品：粉劑×1瓶， 4℃保存。臨用前加入5.743 mL蒸餾水充分溶解；吸取0.1 mL上述溶液，加入0.9 mL蒸餾水，混勻，即為100μmol/L DHA。
樣品中DHA提�。�
1. 組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL試劑一）進行冰浴勻漿。12000g，4℃離心20min，取上清置冰上待測。
2. 細菌、真菌：按照細胞數(shù)量（104個）：試劑一體積（mL）為500~1000：1的比例（建議500萬細胞加入1mL試劑一），冰浴超聲波破碎細胞（功率300w，超聲3秒，間隔7秒，總時間3min）；12000g，4℃離心10min，取上清液置于冰上待測。
3. 血清等液體：直接測定。
DHA測定操作：
1. 分光光度計預(yù)熱30 min，調(diào)節(jié)波長到265 nm，蒸餾水調(diào)零。
2. 試劑二在25℃水浴鍋中預(yù)熱30 min。
3. 標準管：依次在1mL石英比色皿加入100μL標準液、800μL預(yù)熱的試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A1和A2，△A空白管=A2-A1。
4. 測定管：依次在1mL石英比色皿加入100μL上清液、800μL預(yù)熱的試劑二和100μL試劑三，迅速混勻后于265nm比色，記錄10s和130s的吸光值A3和A4，△A測定管=A4-A3。
注意：標準管只需測定一次。
計算公式：
(1). 按蛋白濃度計算
DHA(nmol/mg prot) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷（Cpr×V樣）
=100×△A測定管÷△A標準管÷Cpr
(2). 按樣本質(zhì)量計算
DHA(nmol/g鮮重) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)
=100×△A測定管÷△A標準管÷W
(3). 按細胞數(shù)量計算
DHA(nmol/104 cell) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷(W×V樣÷V樣總)
=100×△A測定管÷△A標準管÷細胞數(shù)量
（4）按液體體積計算
DHA(nmol/mL) =[C標準液×△A測定管÷△A標準管×V標準]÷V樣
=100×△A測定管÷△A標準管
C標準液：100μmol/L；V標準：加入反應(yīng)體系中標準液體積，0.1mL；V樣總：上清液總體積，1.0 mL=0.001 L；V樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，0.1mL；W：樣品質(zhì)量，g。
