注 意：正式測定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測定。
測定意義：
生物體內(nèi)巰基主要包括非蛋白質(zhì)巰基和蛋白質(zhì)巰基。巰基化合物在體內(nèi)具有重要的解毒功能，對(duì)生物體的自我調(diào)節(jié)具有非常重要的生理意義。
測定原理：
巰基基團(tuán)與5,5’- 二硫代-雙-硝基苯甲酸（DTNB）反應(yīng)，生成黃色化合物，在412nm處有最大吸收峰。
自備實(shí)驗(yàn)用品：
天平、研缽、可見分光光度計(jì)、恒溫水浴鍋、1mL玻璃比色皿、乙醇和蒸餾水。
試劑組成和配制：
提取液：液體50 mL×1瓶，4℃保存。
試劑一：液體40 mL×1瓶，4℃保存。
試劑二：液體2mL×1瓶，4℃避光保存。
樣品的制備：
1. 按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(mL)為1：5~10的比例（建議稱取約0.1g組織，加入1mL提取液）進(jìn)行冰浴勻漿，然后8000g，4℃離心10min，取上清，置冰上待測。
2. 血清，培養(yǎng)液：取0.1mL樣本，加入0.4mL提取液，混勻，室溫靜置10min, 然后8000g，4℃離心10min，
3. 取上清，置冰上待測。
操作步驟：
1、 分光光度計(jì)預(yù)熱30min，調(diào)節(jié)波長至412nm，雙蒸水調(diào)零。
2、 操作表
在1mL玻璃比色皿中加入如下試劑
|
| 對(duì)照管 | 測定管 |
| 樣品（μL） | 200 | 200 |
| 試劑一（μL） | 750 | 750 |
| 試劑二（μL） |
| 50 |
| 乙醇（μL） | 50 |
|
| 混勻，25℃靜置10min， 測定412nm吸光值，ΔA=A測定-A對(duì)照。每個(gè)測定管設(shè)一個(gè)對(duì)照管。 | ||
計(jì)算公式：
非蛋白巰基標(biāo)準(zhǔn)曲線：y =3.6222 x- 0.0037，R2 = 1，x為標(biāo)品濃度，單位μmol/mL， y為吸光度ΔA。
1. 組織：
（1）按樣本重量計(jì)算
非蛋白巰基含量（μmol/g 鮮重）=（ΔA+0.0037）÷3.6222 ×V樣總÷W
=0.276×（ΔA+0.0037）÷W
（2）按樣本蛋白濃度計(jì)算
非蛋白巰基含量（μmol/mg prot）=（ΔA+0.0037）÷3.6222×V樣總÷Cpr
=0.276×（ΔA+0.0037）÷Cpr
2. 血清、培養(yǎng)液：
非蛋白巰基含量（μmol/L）=（ΔA+0.0037）÷3.6222×5 ×103
=1380×（ΔA+0.0037）
V樣總：加入提取液體積，1mL；W：樣品質(zhì)量，g ；Cpr：樣本蛋白濃度，mg/mL；5：血清，培養(yǎng)液等液體樣本稀釋倍數(shù)；103 ：1mmol/L=103μmol/ L
