| T4多聚核苷酸激酶能夠催化ATP的 γ-位磷酸基團(tuán)轉(zhuǎn)移到寡核苷酸鏈（雙鏈或單鏈DNA或RNA）的 5’-羥基末端以及3’-單磷酸核苷上。T4 多聚核苷酸激酶還具有3’磷酸酶活性，將3’-磷酸基團(tuán)從寡核苷酸的3’磷酸末端、脫氧3’-單磷酸核苷和脫氧3’-二磷酸核苷上水解掉。該酶經(jīng)修飾后，其3’磷酸酶活性缺失，但仍保留了所有激酶的活性。 | ||||||||||
組分 | ||||||||||
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應(yīng)用 | ||||||||||
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活性定義 | ||||||||||
| 1 單位指 37℃條件下，30 分鐘內(nèi)催化1nmol 酸不溶性[32P] 摻入所需要的酶量。 | ||||||||||
儲(chǔ)存 | ||||||||||
| -20℃可保存3年。 | ||||||||||
使用注意事項(xiàng) | ||||||||||
| （1）1× T4 多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液：70 mM Tris-HCl pH 7.6，10 mM MgCl2，5 mM DTT，37℃ 溫育。 （2）熱失活：65℃ 加熱 20 分鐘。 （3）在放射性標(biāo)記實(shí)驗(yàn)中，可用 1× T4 多聚核苷酸激酶反應(yīng)緩沖液、50pmol的γ-[32P] ATP和20單位的酶37℃溫育30分鐘。 （4）T4多聚核苷酸激酶需要ATP才能發(fā)揮活性，但是為了適用于高活力的放射性標(biāo)記反應(yīng)，在隨酶提供的反應(yīng)緩沖液中不含ATP。因此在磷酸化修飾核酸時(shí)請(qǐng)單獨(dú)添加終濃度0.5~1mM ATP。 （5）要提高平齊末端或5’凹陷末端的磷酸化效率，可在加入T4多聚核苷酸激酶前，先將DNA溶液于70℃加熱5分鐘，然后冰上冷卻，并加入5%（W/V）的PEG-8000。 （6）一般來(lái)說(shuō)，進(jìn)行激酶反應(yīng)之后是連接反應(yīng)。在這種情況下，T4多聚核苷酸激酶反應(yīng)在連接酶反應(yīng)緩沖液中37℃ 溫育30分鐘即可。反應(yīng)后的產(chǎn)物可直接進(jìn)行連接，無(wú)需改變緩沖液和進(jìn)行熱失活。如果連接時(shí)需要保持其它DNA片段的去磷酸化狀態(tài)，則需要在連接反應(yīng)前熱失活T4多聚核苷酸激酶。 | ||||||||||
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