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3173 DNA聚合酶

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3173 DNA Polymerase為來源于病毒的熱穩(wěn)定型DNA聚合酶，通過點突變修飾，使其3’-5’外切活性缺失（exo-形式）而獲得更佳的擴增活性。該酶除了具有依賴于DNA的聚合酶活性，還具有依賴于RNA的逆轉(zhuǎn)錄活性，因此可用于單管RT-PCR擴增。該酶具有強烈的鏈置換活性，可用于DNA或RNA的等溫擴增。在以RNA為模板的LAMP實驗中，可實現(xiàn)單酶系統(tǒng)反應。對于有復雜二級結(jié)構(gòu)的RNA模板，可通過92度加熱3s來得到好的擴增效果，而Bst pol在此溫度加熱后導致擴增活性喪失。
3173 DNA 聚合酶在95°C條件下的半衰期為20min，因此PCR的起始預變性時間通常為1~2min。該酶搭配兩種Buffer：10×3173 Isothermal Buffer和5×Best PCR Buffer。10×3173 Isothermal Buffer用于恒溫PCR擴增，其反應溫度不能超過70°C。 5×Best PCR Buffer用于常規(guī)PCR擴增，94°C預變性時間不可超過5min。

主要特征
  • 同時具有較強的延伸能力和逆轉(zhuǎn)錄活性
  • 耐熱性能極強，對于復雜模板的擴增活性強
  • 強烈的鏈置換活性，可應用于LAMP檢測

組分
組分名稱 數(shù)量
3173 DNA Polymerase (5 U/μl) 100 μl
10×3173 Isothermal Buffer 1 ml
5×Best PCR Buffer 1 ml

單位定義
一個活力單位即在65°C條件下，30分鐘內(nèi)催化25nmol dNTP的摻入反應成為酸不溶性物質(zhì)所需的酶量。

應用
  • 恒溫PCR擴增
  • DNA LAMP和RT-LAMP
  • 鏈置換基因合成
  • 在60-70度之間具有反轉(zhuǎn)錄活性，可用于單管RT-PCR

儲存
-20℃可保存3年。

使用方法
1.以DNA為模板進行PCR擴增
反應體系配制
3173 DNA Polymerase (5 U/μl)                     1 μl
5×Best PCR Buffer                                    10 μl
dNTP Mixture (2.5 mM each)                        4 μl
模板DNA                                              1ng~1ug
上游引物（10 μM）                                       5 μl
下游引物（10 μM）                                       5 μl
ddH2O                                              Up to 50 ul		 PCR擴增循環(huán)參數(shù) 
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
1st Cycle 90°C 2min
25-40 Cycles 90°C 15s
Tm 15s
72°C 1kb/1min
Last Cycle 72°C 5min
2.以RNA為模板進行RT-PCR擴增
反應體系配制
3173 DNA Polymerase (5 U/μl)                     1 μl
5×Best PCR Buffer                                    25 μl
dNTP Mixture (10 mM each)                        5 μl
模板RNA                                            10ng~1ug
上游引物（10 μM）                                     2 μl
下游引物（10 μM）                                     2 μl
ddH2O                                           Up to 50 ul		 PCR擴增循環(huán)參數(shù) 
循環(huán)數(shù) 溫度 時間
1st Cycle 60°C 60min
35 Cycles 90°C 15s
57°C 15s
72°C 1kb/1min
Last Cycle 72°C 5min
3.缺刻恒溫PCR擴增
3173 DNA Polymerase (5 U/μl)                   1 μl
10×3173 Isothermal Buffer                         5 μl
dNTP Mixture (10 mM each)                      5 μl
模板DNA                                         10ng~1ug
引物（500 μM）                                         5 μl
ddH2O                                           Up to 50 μl
55°C孵育2~8h。
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