| CRISPR/Cas9是一種由RNA指導(dǎo)Cas核酸酶對(duì)靶向基因進(jìn)行特定DNA修飾的技術(shù)，也是細(xì)菌和古細(xì)菌為應(yīng)對(duì)噬菌體和外源質(zhì)粒的攻擊而演化來(lái)的一種獲得性免疫防御機(jī)制。此系統(tǒng)的工作原理是通過(guò)人工優(yōu)化的具有引導(dǎo)作用的sgRNA(Single Guide RNA)引導(dǎo)核酸酶Cas9蛋白在與sgRNA配對(duì)的靶位點(diǎn)處剪切雙鏈DNA，引起DNA斷裂，進(jìn)而利用生物體內(nèi)非同源末端修復(fù)機(jī)制或同源重組機(jī)制修復(fù)DNA，導(dǎo)致基因移碼突變、替換或刪除，致使基因功能喪失。 sgRNA的體外合成通常有兩種策略：一種為構(gòu)建含特異性序列的轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒，另一種則使用合成的oligo退火延伸生成含T7轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子的雙鏈DNA分子，進(jìn)而再使用T7 RNA聚合酶進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，從而獲得sgRNA。利用合成的Oligo直接制備sgRNA，具有操作簡(jiǎn)單快速、可實(shí)現(xiàn)高通量等優(yōu)勢(shì)，已經(jīng)成為體外合成sgRNA的首選方案。Cas9的切割是通過(guò)向?qū)NA(gRNA)與靶DNA形成約20bp堿基的配對(duì)，且靶序列的3’端需要有PAM結(jié)構(gòu)(NGG)，再引導(dǎo)Cas9作用實(shí)現(xiàn)的。本試劑盒可通過(guò)一步反應(yīng)獲得高純度、高產(chǎn)量的sgRNA，僅需要合成一條含有特定靶標(biāo)序列的Oligo，可最短在4h內(nèi)獲得50~80 μg的sgRNA。 | ||||||||||||||||
組份 | ||||||||||||||||
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| 注意：Positive Sense sgRNA Oligo為陽(yáng)性對(duì)照品，在實(shí)驗(yàn)時(shí)可用于質(zhì)控反應(yīng)體系。 | ||||||||||||||||
原理 | ||||||||||||||||
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儲(chǔ)存 | ||||||||||||||||
| -20℃可保存2年，避免反復(fù)凍融。 | ||||||||||||||||
實(shí)例 | ||||||||||||||||
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| Fig. 一步法sgRNA合成試劑盒獲得的sgRNA，分別為37℃孵育30min、1h、2h、8h和過(guò)夜孵育的sgRNA，孵育時(shí)間越長(zhǎng)，sgRNA產(chǎn)量越高。 | ||||||||||||||||
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