| pUC57 Simple通用克隆載體采用了TOPO酶連接技術(shù)，載體預(yù)先偶聯(lián)上TOPO酶，當(dāng)加入PCR擴(kuò)增產(chǎn)物后，5 min就可以完成連接反應(yīng)，連接陽(yáng)性率高。pUC57 Simple通用克隆載體消除了大部分的常用酶切位點(diǎn)，便于后續(xù)亞克隆。該產(chǎn)品適用于Taq酶擴(kuò)增的含“A”尾巴和高保真酶擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物的連接，載體含有氨芐青霉素抗性篩選標(biāo)記。 | ||||||||||||||||||
優(yōu)勢(shì) | ||||||||||||||||||
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組分 | ||||||||||||||||||
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儲(chǔ)存 | ||||||||||||||||||
| RTS DH5α凍干感受態(tài)在未溶解狀態(tài)下，可于-20℃長(zhǎng)期保存（>2年），已經(jīng)溶解后，請(qǐng)-60℃以下保存（3個(gè)月）。 | ||||||||||||||||||
圖譜 | ||||||||||||||||||
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測(cè)序引物 | ||||||||||||||||||
| 正向測(cè)序引物：M13F(-47): 5’- CGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGAC-3’； 反向測(cè)序引物：M13R(-48): 5’- AGCGGATAACAATTTCACACAGGA-3’； | ||||||||||||||||||
實(shí)例 | ||||||||||||||||||
| 1.應(yīng)用pUC57 Simple TA平端通用克隆載體分別連接長(zhǎng)度為2008bp的平端產(chǎn)物和A尾產(chǎn)物，挑20個(gè)菌進(jìn)行菌檢，陽(yáng)性率分別為95%和85%。 | ||||||||||||||||||
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| 2.不同的載體與片段的摩爾比對(duì)連接效率的影響 片段長(zhǎng)2432bp，使用載體與片段摩爾比分別為1:1；1:2；1:3；1:4；1:5；1:6；1:7；1:8；1:9；1：10 室溫連接5min后轉(zhuǎn)入RTS-DH5α凍干感受態(tài)，通用引物菌檢陽(yáng)性片段長(zhǎng)度為菌檢陽(yáng)性片段大小為2572bp。結(jié)果表明載體與片段摩爾比1:1；1:2；1:3；1:4；1:6；1:9時(shí)均有較高的陽(yáng)性率，而1:5；1:7；1:8；1：10則陽(yáng)性率稍低，說(shuō)明連接反應(yīng)時(shí)應(yīng)選擇正確的載體與連接片段摩爾比，推薦最佳摩爾比為1:3。 | ||||||||||||||||||
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| 3.不同連接時(shí)間對(duì)連接效率的影響 平端產(chǎn)物片段長(zhǎng)2432bp，載體與片段摩爾比分別為1:3，分別室溫連接5min、10min、15min、20min、25min、30min后轉(zhuǎn)入RTS-DH5α凍干感受態(tài)，通用引物菌檢陽(yáng)性片段長(zhǎng)度為菌檢陽(yáng)性片段大小為2572bp。結(jié)果表明不同的連接時(shí)間對(duì)于菌斑數(shù)和陽(yáng)性率的影響較小，無(wú)明顯差別，建議當(dāng)連接片段<2500bp時(shí)，可選擇室溫連接5min。 | ||||||||||||||||||
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| 4.不同長(zhǎng)度的平端產(chǎn)物片段對(duì)連接效率的影響 平端產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為500bp、1kb、2kb和5kb，載體與片段摩爾比分別為1:3，前三個(gè)片段室溫連接5min，5kb片段室溫連接30min，轉(zhuǎn)入RTS-DH5α凍干感受態(tài)，通用引物菌檢。結(jié)果表明長(zhǎng)片段連接后菌斑數(shù)較短片段減少，但陽(yáng)性率無(wú)明顯差別。 | ||||||||||||||||||
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| 5.不同長(zhǎng)度的A尾產(chǎn)物片段對(duì)連接效率的影響 A尾產(chǎn)物片段長(zhǎng)度分別為500bp、1kb、2kb、2.5kb和5kb，載體與片段摩爾比分別為1:3，前四個(gè)片段室溫連接5min，5kb片段室溫連接30min，轉(zhuǎn)入RTS-DH5α凍干感受態(tài)，通用引物菌檢。結(jié)果表明片段長(zhǎng)度在500bp~2.5kb之間時(shí)陽(yáng)性率無(wú)明顯差別，當(dāng)片段長(zhǎng)度≥5kb時(shí)陽(yáng)性率有所降低，此時(shí)應(yīng)適當(dāng)增加菌檢數(shù)量。 | ||||||||||||||||||
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