Western Blot 檢測試劑盒說明書（簡化版）
（YW001-1）
【產(chǎn)品簡介】
蛋白印跡，也稱 Western，Western blot、Western blotting、Western 印跡，簡稱 WB，是用抗體檢測蛋白的重要方法之一。在蛋白質(zhì)進(jìn)行 SDS-PAGE 電泳后，利用 Western Blotting 檢測試劑盒可以完成轉(zhuǎn)膜，膜的封閉，一抗孵育，二抗孵育和 ECL 化學(xué)發(fā)光檢測的工作。
【試劑盒組份】
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組份 | W001-1-1 10T | W001-1-2 20T |
儲存溫度 |
| PVDF 膜（5cm×7cm） | 10 張 | 20 張 | RT |
| 10×轉(zhuǎn)移緩沖液 | 500 ml | 500 ml ×2 | 4℃ |
| Tween 20 | 1.5 ml | 3.0 ml | 4℃ |
| 10×洗滌液 | 250 ml | 500 ml | 4℃ |
| BSA | 6g | 12g | 4℃ |
| 二抗（兩種供選擇） | |||
| 羊抗小鼠 IgG-HRP | 20ul | 40ul | -20℃ |
| 羊抗兔 IgG-HRP | 20ul | 40ul | -20℃ |
| ECL 化學(xué)發(fā)光試劑 | |||
| A 液 （避光） | 5 ml | 10 ml | 4℃ |
| B 液 | 5 ml | 10 ml | 4℃ |
【自備儀器和試劑】
可調(diào)移液器、垂直板電泳儀、X光片、雙蒸水、一抗，無水甲醇，顯影液，定影液
【保存條件】
PVDF膜室溫保存；二抗-20℃保存；其余組份4℃保存。
【操作步驟】
1、 工作液的準(zhǔn)備：
轉(zhuǎn)膜緩沖液配制（1000ml）：
100ml 10×轉(zhuǎn)移緩沖液＋700ml 去離子水＋200ml 無水甲醇，可重復(fù)使用一次。洗滌液的配制（300ml）： 30ml 10×洗滌液＋270ml 去離子水＋150ul Tween 20
封閉液的配制（20ml）： 20ml 洗滌液＋0.6g BSA
2、 轉(zhuǎn)膜
a、PVDF 膜及濾紙的預(yù)處理：
轉(zhuǎn)膜前，裁剪與膠大小一致的 PVDF 膜泡入甲醇中，時(shí)間約為 1min，小心取出膜放入蒸餾水中浸泡 2min，然后把膜放置盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的小槽中平衡 15min，同時(shí)把已裁剪好的濾紙（與膠大小一致）和海綿也放入盛有轉(zhuǎn)膜緩沖液的小槽中平衡 15min。
b、 轉(zhuǎn)膜
（1） 、干式電轉(zhuǎn)印
將轉(zhuǎn)印槽陰極平放工作臺上，并在上面加三張經(jīng)轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡好的 1mm 厚的濾紙，將經(jīng)轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡好的 PVDF 膜放在濾紙上，再將凝膠平放在 PVDF 膜上，最后在凝膠上加蓋三層經(jīng)轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡好 1mm 厚的濾紙， 接通電源，15V 進(jìn)行恒壓，轉(zhuǎn)膜的時(shí)間根據(jù)蛋白分子量的大小而調(diào)整，分子量為40－100KD 的蛋白轉(zhuǎn)膜30-45min。
（2） 、濕式電轉(zhuǎn)印
打開電轉(zhuǎn)夾，每側(cè)墊上一塊專用的轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡好的海面墊，再各放三塊經(jīng)轉(zhuǎn) 膜緩沖液平衡好的濾紙，濾紙與海面墊大小相同或與 PVDF 膜、凝膠大小相同均可， 將凝膠平放在陰極側(cè)濾紙上，最后將經(jīng)轉(zhuǎn)膜緩沖液平衡好 PVDF 膜平放在凝膠上，按 照 (-) 夾板-海棉-濾紙-凝膠-PVDF 膜-濾紙-海綿-夾板 (+)裝好，除盡氣泡，夾好電轉(zhuǎn) 印夾。 電泳槽（槽的一邊放一塊冰來降溫）加滿預(yù)冷的轉(zhuǎn)膜緩沖液，插入電轉(zhuǎn)印夾，連接好電極，接通電流，轉(zhuǎn)印夾的 PVDF 膜應(yīng)對電泳槽的正極， 100v 恒壓進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，，轉(zhuǎn)膜的時(shí)間根據(jù)蛋白分子量的大小而調(diào)整，分子量為 40－100KD 的蛋白轉(zhuǎn)膜 60min。
3、 膜的封閉
轉(zhuǎn)膜完畢后，立即把蛋白膜放置到預(yù)先準(zhǔn)備好的 Western 洗滌液中，漂洗 1-2 分鐘，以洗去膜上的轉(zhuǎn)膜液。從轉(zhuǎn)膜完畢后所有的步驟，一定要注意膜的保濕，避免膜的干燥，否則極易產(chǎn)生較高的背景。
用滴管等吸盡洗滌液，加入 Western 封閉液，在搖床上緩慢搖動，室溫封閉 60 分鐘。對于一些背景較高的抗體，可以 4℃封閉過夜。在整個(gè) Western 過程中我們推薦使用側(cè)擺搖床或類似儀器，側(cè)向擺動速度比較緩慢，而且也容易讓溶液覆蓋蛋白膜。
4、 一抗孵育
參考一抗的說明書，按比例用封閉液稀釋一抗�？捎� 10×10cm 雜交袋進(jìn)行一抗孵育，所需一抗孵育約為 1.0ml，室溫或 4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時(shí)。如果效果不佳，可以在 4℃緩慢搖動孵育過夜。取出膜，加入洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌 10 分鐘。吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗 3～5 次，每次 5-10 分鐘。如果結(jié)果背景較高可以適當(dāng)延長漂洗時(shí)間并增加漂洗次數(shù)。Western 結(jié)果通常需要提供內(nèi)參作為對照，通�？�以選用 Tubulin 抗體或 Actin 抗體，進(jìn)行內(nèi)參檢測。
5、 二抗孵育
根據(jù)一抗的類型，選擇合適的二抗并參考二抗的說明書，例如，一抗是小鼠來源的 IgG，則二抗需選擇抗小鼠 IgG 的二抗； 并按照適當(dāng)比例用封閉液稀釋辣根過氧化物酶(HRP)
標(biāo)記的二抗（1:10000 左右）。可用 10×10cm 雜交袋進(jìn)行二抗孵育，所需二抗孵育約為 1.0ml，室溫或 4℃在側(cè)擺搖床上緩慢搖動孵育一小時(shí)。加入洗滌液，在側(cè)擺搖床上緩慢搖動洗滌 10 分鐘。用滴管吸盡洗滌液后，再加入洗滌液，漂洗 3～5 次，每次 5-10 分鐘。如果顯色結(jié)果背景較高，可以適當(dāng)延長洗滌時(shí)間并增加洗滌次數(shù)。
6、 ECL 化學(xué)發(fā)光檢測
a、 ECL 工作液的配制：
取 1.5ml 的 eppendorf 管，加入 500μl A 液和 500μl B 液，然后加入 1μl 增強(qiáng)劑，混勻后即為 ECL 工作液（配制后請盡快使用）。用平頭鑷將膜取出，用吸水紙略吸去過多的液體(切勿接觸膜的蛋白面)，然后置于一潔凈保鮮膜上。
b、 根據(jù)膜的大小，按每 10 平方厘米膜加 1ml ECL 工作液的比例，滴加 ECL 工作液到膜上，確保使工作液均勻覆蓋在膜上，放置 1-2 分鐘。
c、 取膜，棄 ECL 工作液，用吸水紙略吸去過多的液體。將膜放在兩片保鮮膜中間，小心趕盡氣泡。
d、 將膜固定于片夾內(nèi)。暗室內(nèi)壓片 1 分鐘，立即顯影定影，根據(jù)結(jié)果再調(diào)整壓片時(shí)間。或直接分別壓片 30 秒，1，3，5 分鐘，然后一起顯影定影觀察結(jié)果。
