一、細(xì)胞培養(yǎng)條件

T25 細(xì)胞到貨處理

觀察：

1 、收到細(xì)胞后，請(qǐng)及時(shí)核對(duì)培養(yǎng)瓶上標(biāo)注的細(xì)胞名稱是否與訂購(gòu)的細(xì)胞名稱一致以及培養(yǎng) 瓶是否有破損或漏液等異常情況。

處理：

1 、75%酒精棉球擦拭 T25 細(xì)胞培養(yǎng)瓶外部。

2 、顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，并對(duì)細(xì)胞進(jìn)行不同倍數(shù)拍照保存 (40x, 100x,200x 各一張) 前 三天照片為重要售后依據(jù)，不提供照片默認(rèn)收到狀態(tài)良好。

3 、不要打開培養(yǎng)瓶蓋，將細(xì)胞放入 37 度培養(yǎng)箱中靜置 3-4 小時(shí)后再做處理，以穩(wěn)定細(xì)胞狀 態(tài)。

4 、收到細(xì)胞后，及時(shí)查看說明書是貼壁細(xì)胞還是懸浮細(xì)胞形態(tài)，并按常規(guī)貼壁或懸浮細(xì)胞 的傳代方法操作。

貼壁：未超過 80%匯合度時(shí)，將瓶裝的完全培養(yǎng)液收集至離心管中，留 5ml 完全培養(yǎng)基， 放入 37℃ 、5%CO2 孵箱培養(yǎng)；超過 80%匯合度時(shí)，根據(jù)情況傳代或者凍存，具體操作見細(xì)胞 培養(yǎng)步驟。首次傳代，建議 1:2 傳代 (兩個(gè) T25) 。(傳代時(shí)建議一瓶用原瓶里面的完全培養(yǎng) 基，另外一瓶用自己配的完全培養(yǎng)基，進(jìn)行對(duì)比培養(yǎng)。)

特殊細(xì)胞注意事項(xiàng)：個(gè)別細(xì)胞貼壁不牢，在運(yùn)輸過程中發(fā)生細(xì)胞脫落，這是正�，F(xiàn)象。 請(qǐng)將培養(yǎng)瓶所有培養(yǎng)液收集至離心管，1000rpm 離心 5min，收集上清 (后期對(duì)比培養(yǎng)使用)， 沉淀加入胰酶 1-2ml ，輕輕吹打，重懸，消化 1-2 分鐘后，加 5ml 完全培養(yǎng)基終止反應(yīng)。再 離心，棄上清，加 1-2ml 完全培養(yǎng)基重懸。然后按 1:2 比例進(jìn)行分瓶傳代 (兩個(gè) T25) ，補(bǔ)充 新的完全培養(yǎng)基至 5-8ml/瓶，最后放入 37℃,5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

(注意：如收到密封培養(yǎng)瓶，處理完后放入培養(yǎng)箱培養(yǎng)時(shí)要將培養(yǎng)瓶蓋子擰松)

凍存細(xì)胞到貨處理

1 、收到細(xì)胞后，檢查外包裝情況和箱內(nèi)是否還有干冰。如有外包裝破損干冰已完全揮發(fā)等 問題，請(qǐng)即時(shí)聯(lián)系。

2 、將細(xì)胞取出轉(zhuǎn)移至液氮或－80 度冰箱保存，建議盡早復(fù)蘇。

3 、復(fù)蘇第一管如有活性狀態(tài)問題及時(shí)與我們聯(lián)系，會(huì)有技術(shù)人員與您溝通指導(dǎo)后再?gòu)?fù)蘇第 二管。特別說明：未與我方聯(lián)系擅自復(fù)蘇第二管出現(xiàn)問題不予售后。

細(xì)胞復(fù)蘇

1 、  從液氮中取出細(xì)胞凍存管 (注意：佩戴防爆管面具) ，快速將其置入 37℃水浴中解凍， 直至凍存管中無結(jié)晶，然后用 75%的酒精擦拭凍存管外壁；

2 、將凍存管中的細(xì)胞移至含 5ml 完全培養(yǎng)基的 15ml 離心管中，1000rpm 離心 5min；

3 、棄上清，沉淀用 5ml 完全培養(yǎng)基重懸，接種 T25 培養(yǎng)瓶，于 37℃,5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中 培養(yǎng)；

4 、第二天，換用新鮮完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

細(xì)胞傳代

1、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的 80%面積時(shí)，棄 T25 培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞一次：

2 、添加 0.25%胰蛋白酶消化液約 1ml 至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后 加入 5ml 完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管 中，1000rpm 離心 5min；

3 、棄上清，沉淀細(xì)胞用 1-2ml 完全培養(yǎng)基重懸，然后按 1:2 比例進(jìn)行分瓶傳代 (兩個(gè) T25)， 補(bǔ)充新的完全培養(yǎng)基至 5-8ml/瓶，最后放入 37℃,5%CO2 細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

細(xì)胞凍存

1、細(xì)胞生長(zhǎng)至覆蓋培養(yǎng)瓶的 80%面積時(shí)，棄 T25 培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液，用 PBS 清洗細(xì)胞一次；

2 、添加 0.25%胰蛋白酶消化液約 1ml 至培養(yǎng)瓶中，倒置顯微鏡下觀察，待細(xì)胞回縮變圓后 加入 5ml 完全培養(yǎng)液終止消化，再輕輕吹打細(xì)胞使之脫落，然后將懸液轉(zhuǎn)移至 15ml 離心管 中，1000rpm 離心 5min；

3 、 棄上清，沉淀細(xì)胞加入 1ml/支的雅吉無血清凍存液 (7001) ，混勻后加入凍存管中。 (如：凍一支，加入 1ml 無血清凍存液)

4 、  將凍存細(xì)胞直接放入－80℃冰箱即可；如后期要將細(xì)胞轉(zhuǎn)入液氮罐中，需在-80℃冰箱 存放 24 小時(shí)以上。