GV3101 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞
GV3101 Chemically Competent Cell
保存條件： -80℃
產(chǎn)品規(guī)格:
| GV3101 | 10x100μl |
| pCAMBIA2301 (control vector) | 10ng/ul ；10ul |
| 基 因 型 |
C58 (rif R) Ti pMP90 (pTiC58DT-DNA) ( gentR/strepR) Nopaline
| 簡(jiǎn) 要 說 明 |
GV3101 菌株為 C58 型背景，核基因中含有篩選標(biāo)簽——利福平抗性基因 rif，為了便于轉(zhuǎn)化操作，此菌株攜帶一 無自身轉(zhuǎn)運(yùn)功能的胭脂堿型 Ti 質(zhì)粒 pMP90 (pTiC58DT-DNA) ，此質(zhì)粒含有 vir 基因(vir 基因是 T-DNA 插入植物基因 組必需的元件，pMP90 (pTiC58DT-DNA)質(zhì)粒自身的 T-DNA 轉(zhuǎn)移功能被破壞，但可以幫助轉(zhuǎn)入的雙元載體 T-DNA 順 利轉(zhuǎn)移)。 pMP90 (pTiC58DT-DNA)型 Ti 質(zhì)粒含有篩選標(biāo)簽：Strep 和gent ，賦予 GV3101 菌株鏈霉素和慶大霉素抗 性，適用于擬南芥、煙草、玉米、土豆等植物的轉(zhuǎn)基因操作，GV3101 化轉(zhuǎn)感受態(tài)經(jīng)特殊工藝制作，經(jīng) pCAMBIA2301 質(zhì)粒檢測(cè)轉(zhuǎn)化效率可達(dá) 104cfu/μg。
| 操 作 說 明 |
1. 取-80℃保存的農(nóng)桿菌感受態(tài)于冰上待其部分融化，處于冰水混合狀態(tài)時(shí)插入冰中。
2. 每 100μl 感受態(tài)加 1ug (體積不大于 10ul) 質(zhì)粒 DNA，用手撥打管底混勻，依次于冰上靜置 5 分鐘、液氮 5 分鐘、 28℃水浴 5 分鐘、 冰浴 5 分鐘。
3. 加入 700μl 無抗生素的 LB 或 YEB 液體培養(yǎng)基， 于 28℃振蕩培養(yǎng) 2~3 小時(shí)。
4. 6000rpm 離心一分鐘收菌，留取 100μl 左右上清輕輕吹打重懸菌塊涂布于含相應(yīng)抗生素的 LB 或 YEB 平板上，倒 置放于 28℃培養(yǎng)箱培養(yǎng) 2-3 天(當(dāng)平板只含有 50ug/ml kan 時(shí)，28℃培養(yǎng) 48h 即可；平板中同時(shí)加入 50ug/ml kan ，20ug/ml rif 時(shí)， 需 28℃培養(yǎng) 60h ；如果使用的平板含有 50ug/ml rif 則需要 28℃培養(yǎng) 72-90h)。
| 注 意 事 項(xiàng) |
1. 加入質(zhì)粒時(shí)體積不應(yīng)大于感受態(tài)體積的 1/10 ；質(zhì)粒不純或存在乙醇等有機(jī)物污染，轉(zhuǎn)化效率急劇下降；質(zhì)粒增大
一倍，轉(zhuǎn)化效率下降一個(gè)數(shù)量級(jí)。
2. 混入質(zhì)粒時(shí)應(yīng)輕柔操作。
3. 轉(zhuǎn)化高濃度的質(zhì)粒可相應(yīng)減少最終用于涂板的菌量。
4. 利福平濃度不應(yīng)高于 25ug/ul ，過高的利福平濃度不利于農(nóng)桿菌生長(zhǎng)，會(huì)降低其生長(zhǎng)速度和轉(zhuǎn)化效率。本公司感受 態(tài)計(jì)算轉(zhuǎn)化效率時(shí)所用平板只含有 50ug/ml kan ，若所用平板含有 20ug/ml rif 則轉(zhuǎn)化效率降低到 1/2。
5. 培養(yǎng)基中加入利福平的目的是防止雜菌生長(zhǎng)、 篩選農(nóng)桿菌；根據(jù)所用菌株抗性加入鏈霉素或慶大霉素可防止 Ti 質(zhì) 粒丟失，但鏈霉素不利于農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)基因操作，所以一般培養(yǎng)農(nóng)桿菌時(shí)不考慮鏈霉素或慶大霉素，Ti 質(zhì)粒丟失的 概率極低(可以忽略)。
備注：
1. 農(nóng)桿菌相關(guān)抗生素配方：
| 抗生素 | 配方 | 原液 | 工作液 |
| 羧芐青霉素(carb) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 50mg/ml | 50ug/ml |
| 硫酸卡那霉素(kan) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 50mg/ml | 50ug/ml |
| 鏈霉素(strep) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 10mg/ml | 50ug/ml |
| 利福平(rif) | DMSO 溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 10mg/ml | 20ug/ml |
| 慶大霉素(gent) | 雙蒸水溶解， 0.22um 濾膜過濾除菌 | 20mg/ml | 40ug/ml |
2. 常用農(nóng)桿菌抗性： (R：抗；S：敏感。)
| 農(nóng)桿菌菌株 | 羧芐青霉素(carb) | 鏈霉素(strep) | 利福平(rif) | 慶大霉素(gent) | 硫酸卡那霉素(kan) |
| AGL- 1 | R | R | R | S | S |
| EHA105 | S | R | R | S | S |
| LBA4404 | S | R | R | S | S |
| GV3101 | S | R | R | R | S |
3. LB 及 YEB 配方：
| component | LB(液體)/L | LB(固體)/L | component | YEB(液體)/L | YEB(固體)/L |
| Tryptone | 10g | 10g | Tryptone | 5g | 5g |
| Yeast extract | 5g | 5g | Yeast extract | 1g | 1g |
| NaCl | 10g | 10g | 牛肉浸膏 | 5g | 5g |
| NaOH | 調(diào) PH 到 7.0 | 調(diào) PH 到 7.0 | 蔗糖 | 5g | 5g |
| Agar | － | 15g | MgSO4 *7H2O | 0.49g | 0.49g |
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| NaOH | 調(diào) PH 到 7.0 | 調(diào) PH 到 7.0 |
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| Agar | － | 15g |
