AH109 酵母感受態(tài)細胞
AH109 Chemically Competent Cell
產品規(guī)格:10×100μl
保存條件： -80℃
AH109
10×100μl
保存條件： -80℃
Carrier DNA
5ug/μl；100 μl
保存條件 -20℃
PEG/liAC
5 ml
保存條件： 4℃
基 因 型
MATa, trp1-901, leu2-3, 112, ura3-52, his3-200, gal4Δ, gal80Δ,LYS2 : : GAL1UAS-GAL1TATA-HIS3,
MEL1 GAL2UAS-GAL2TATA-ADE2, URA3::MEL1UAS-MEL1TATA-lacZ
簡 要 說 明
AH109 菌株來源于 PJ69-2A 酵母菌株，將 lacZ 報告基因引入 PJ69-2A 誕生了 AH109，此菌株是 Clontech 公司開發(fā)
的 GAL4 系統(tǒng)酵母雙雜實驗用菌株，MATa 型，可直接轉化質�；蚺c MATα型酵母菌株 Y187 通過 mating 操作進行蛋
白互作驗證或篩庫試驗。Transformation marker 為: trp1, leu2，報告基因為：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1。AH109 -GAL4
酵母雙雜系統(tǒng)需要兩種質粒配套使用：PGBKT7 和 PGADT7。質粒 PGBKT7 的篩選標志為 TRP1，用于表達 DNA-BD(來
自酵母轉錄因子 GAL4N 端 1~ 174位氨基酸)與目標蛋白(Bait)的融合蛋白；質粒 PGADT7 的篩選標志為 LEU，用于表
達 AD(GAL4 C 端 768 ~881 位氨基酸)與目標蛋白（
Prey）的融合蛋白。GAL4 系統(tǒng)原理：一個完整的酵母轉錄因子 GAL4
可分為功能上相互獨立的兩個結構域：位于N 端1 ~ 174 位氨基酸區(qū)段的DNA 結合域（DNA-BD）和位于C 端768 ~881 位
氨基酸區(qū)段的轉錄激活域(AD)。DNA-BD 能夠識別 GAL4-responsive gene 的上游激活序列 UAS，并與之結合。而 AD
可以啟動 UAS 下游的基因進行轉錄。BD 和 AD 單獨存在不能激活轉錄，但當二者接近時，則呈現(xiàn)完整的 GAL4 活性，
使含有 UAS 的啟動子下游基因轉錄表達。正常條件下，BD 不與 AD 結合，將要檢測的蛋白質分別與 BD 和 AD 融合，
形成 bait 融合蛋白（
bait -BD）和 prey 融合蛋白（
prey-AD），如果 bait 和 prey 發(fā)生相互作用，就會促使 BD 和 AD 的
相互接近，形成完整的 GAL4，從而激活報告基因的轉錄。AH109 有四個報告基因：lacZ, HIS3, ADE2, MEL1，分別由
三種不同的啟動子（GAL1，GAL2，MEL1）啟動，這三種啟動子只有 GAL4 識別的 17bp核心區(qū)相同，其余部分均不
同，大大降低了酵母雙雜假陽性發(fā)生的概率。AngYuBio High5TM 系列 AH109 感受態(tài)細胞經特殊工藝制作，-80℃可保
存三個月，經 PGADT7 質粒檢測轉化效率>104cfu/μg DNA 。
操 作 說 明
1. 取一支無菌的 1.5ml EP 管，依次加入預冷的目的質粒 1-3µg，Carrier DNA 10µl，100µl 冰上融化的 AH109 感受態(tài)細胞，PEG/LiAc 500µl，輕輕翻轉混勻 6-8 次；
2. 30℃水浴 30min，每 10min 輕輕翻轉混勻 6-8 次；
3. 每支加入 20µl 的二甲基亞砜；（用于提高轉化效率）
4. 42℃水浴 15min，每 5min 輕輕翻轉混勻 6-8 次；
5. 12000rpm 瞬時離心棄上清，每支加入 1ml 的 YPD Plus 于 30℃復蘇 1h；（用于提高轉化效率）
6. 12000rpm 瞬時離心棄上清，用 100µl 0.9% NaCl 重懸，涂板，30℃培養(yǎng) 48-96h。
注 意 事 項
1. 感受態(tài)細胞最好在冰上融化,PEG 溶液在低溫環(huán)境下會析出，請于常溫下完全溶解后使用。
2. 轉化高濃度的質�？上鄳獪p少最終用于涂板的菌量。
3. 同時轉化 2-3 種質粒時可增加質粒的用量。
4. AHA109 酵母菌株對高溫敏感，最適生長溫度為 27-30℃；高于 31℃，生長速度和轉化效率呈指數(shù)下降。
5. 菌落變粉不是污染，是酵母細胞生長中一個常見現(xiàn)象。當細胞在平板培養(yǎng)幾天后，平板上的 Adenine 被酵母消耗完
畢，酵母試圖通過自身代謝途徑合成 Adenine 以供利用，然而，有些菌株的 ADE2 基因被破壞，Adenine 合成途徑
受阻；又由于其 ADE4,5,6,7,8 基因均正常，所以造成中間產物 P-ribosylamino imidazole（AIR）在細胞中積累而使
菌落變?yōu)榉奂t色。
6. 酵母在缺陷培養(yǎng)基中生長速度比 YPDA 培養(yǎng)基慢，培養(yǎng)基中缺陷成分越多，生長越慢，以轉化涂板為例：涂 YPDA
平板 29℃，48h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克�。煌� SD 單缺平板 29℃，48-60h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆，涂 SD 雙缺平
板 29℃，60-80h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆，涂 SD 三缺或四缺平板平板 29℃，80-90h 培養(yǎng)可見直徑 1mm 克隆。
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