本產(chǎn)品是 II發(fā)光法3D細胞活力檢測試劑盒(簡稱CTL 3D II，不同包裝版本，兩者的檢測效果完全一致。本產(chǎn)品，即CTL 3D為即用型液體，其優(yōu)點是無需配制即可以直接使用，但長期保存需要置于-80℃，如果在-20℃保存時間較長后檢測效果會逐漸下降。CTL 3D II，為CTL 3D的凍干粉版本，優(yōu)點是在-20℃保存非常穩(wěn)定，缺點是使用前需要使用提供的緩沖液充分溶解底物凍干粉后才能使用。
傳統(tǒng)的細胞培養(yǎng)大多以二維(Two-Dimensional, 2D)的形式進行，隨著研究的深入，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)2D培養(yǎng)的細胞在生長方式、生長形態(tài)、細胞結(jié)構(gòu)、細胞分化和生物學(xué)功能等方面都與體內(nèi)生理條件下的細胞存在明顯差異，進而可能造成實驗結(jié)果和體內(nèi)的真實情況存在較大偏差 [1-3]。三維(Three-Dimensional, 3D)細胞培養(yǎng)技術(shù)能夠更好地模擬生物體內(nèi)細胞生存的微環(huán)境，細胞也可以保持其正常的生物學(xué)功能，能更好模擬體內(nèi)組織，也能更真實地反映細胞與細胞間、細胞與基質(zhì)間的相互作用，細胞對外源性和內(nèi)源性刺激的應(yīng)答也更接近于在體內(nèi)的情況，3D細胞培養(yǎng)從而成為更具好的體外細胞實驗?zāi)Ｐ停軌颢@得與體內(nèi)實驗更加相近或一致的實驗結(jié)果[4-5]。
3D腫瘤細胞模型越來越多地被用于了解疾病機制和藥物研發(fā)。2D培養(yǎng)的腫瘤細胞，其單側(cè)細胞膜可以均勻地獲得營養(yǎng)和氧氣，而3D培養(yǎng)的腫瘤細胞團的內(nèi)部細胞獲得營養(yǎng)和氧氣的機會更少，形成自然的營養(yǎng)和氧氣梯度，能更好地模擬體內(nèi)微環(huán)境條件，因此3D培養(yǎng)的腫瘤球狀體(Spheroid)或腫瘤類器官(Organoid)等能更好地模擬體內(nèi)腫瘤，更利于小分子藥物篩選或者腫瘤相關(guān)分子機制的研究，也更能準確地預(yù)測藥物治療的體內(nèi)反應(yīng)、療效或毒性。同時，2D腫瘤細胞模型體外擴增有一定局限性，在傳代后容易喪失原腫瘤的遺傳異質(zhì)性，出現(xiàn)優(yōu)勢克隆選擇性，從而降低臨床相關(guān)性。相比于2D細胞模型，3D細胞球或者類器官很多情況下下能提供更可信的研究結(jié)果，簡化并加速藥物評價流程。自2009年小腸類器官首次建立至今，3D細胞和類器官研究已經(jīng)擴展到很多組織系統(tǒng)，并成為生命科學(xué)最熱門的領(lǐng)域之一。
隨著3D細胞培養(yǎng)技術(shù)的日益成熟，3D細胞培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)成為非常常用的研究工具，也越來越受歡迎，在基礎(chǔ)研究和藥物發(fā)現(xiàn)等中的應(yīng)用越來越廣泛，而3D培養(yǎng)條件下的細胞活性檢測也成為一大難點。
ATP，作為最重要的能量分子，在細胞的各種生理、病理過程中起著重要作用。ATP是細胞新陳代謝的一個重要指標，也是具有代謝活性細胞的重要標志性分子，并和活細胞數(shù)目成良好的線性關(guān)系。因此，ATP含量能很好地反應(yīng)活細胞的數(shù)目，即可以通過測定ATP含量來檢測細胞活力。
本試劑盒的檢測試劑經(jīng)過優(yōu)化具有強勁的裂解能力，可有效滲透至3D培養(yǎng)形成的球狀體內(nèi)部，裂解所有細胞并釋放出ATP，最終通過測定ATP含量來檢測細胞活力。本試劑盒通過ATP檢測細胞活力的原理參見圖1。借助ATP依賴的螢光素酶催化的螢光素發(fā)光反應(yīng)，ATP可以通過測定化學(xué)發(fā)光來進行定量。由于ATP含量能很好地反映活細胞的數(shù)目，而ATP含量和發(fā)光強度成正比，這樣就可以簡單地通過化學(xué)發(fā)光強度來計算出細胞活力或細胞數(shù)目。
圖1. 發(fā)光法3D細胞活力檢測試劑盒(C0061)檢測ATP的原理圖。
本產(chǎn)品操作簡單，讀數(shù)穩(wěn)定，檢測速度快，完成檢測僅需約30分鐘。本產(chǎn)品比其它3D細胞活力測定方法更加簡單便捷，只需把試劑盒提供的發(fā)光法3D檢測試劑與細胞培養(yǎng)液等體積混合，振蕩5分鐘，再室溫孵育25分鐘后即可進行化學(xué)發(fā)光檢測。無需洗滌細胞，也無需更換或去除培養(yǎng)液。并且化學(xué)發(fā)光比較穩(wěn)定，在反應(yīng)開始后的10分鐘內(nèi)下降不超過10%，30分鐘內(nèi)的下降不超過30%，信號半衰期長達2-3小時。
本試劑盒的性能基本達到甚至在有些方面優(yōu)于國外同類產(chǎn)品。本產(chǎn)品的用途與Promega公司的CellTiter-Glo® 3D Cell Viability Assay (簡稱CellTiter-Glo® 3D)基本相同。3D培養(yǎng)的細胞用本產(chǎn)品和國外同類產(chǎn)品(Competitor P)作用后細胞狀態(tài)基本一致(圖2)，但本產(chǎn)品的檢測靈敏度顯著優(yōu)于國外同類產(chǎn)品(Competitor P) (圖3、圖4B)，發(fā)光強度比國外同類產(chǎn)品提高了約15%，化學(xué)發(fā)光的信號穩(wěn)定性與國外同類產(chǎn)品(Competitor P)基本一致(圖4C)。本產(chǎn)品與國外同類產(chǎn)品(Competitor P)的檢測效果見圖2、圖3、圖4B和4C。
圖2. 發(fā)光法3D細胞活力檢測試劑盒(C0061)和國外同類產(chǎn)品(Competitor P)加入到3D培養(yǎng)的細胞前后的細胞狀態(tài)圖。10,000個HCT-116細胞接種于康寧®球體微孔板(Corning® 96-well Black/Clear Round Bottom Ultra-Low Attachment Surface Spheroid Microplate, Cat.4515/4520)，培養(yǎng)72小時后加入本產(chǎn)品和Competitor P。圖A和圖B為加入3D細胞活力檢測試劑前的3D細胞球；圖C和圖D為加入3D細胞活力檢測試劑作用5分鐘后的3D細胞球形態(tài)；圖E和圖F為3D細胞活力檢測試劑作用后，對細胞的染色效果圖。實際檢測效果會因細胞種類、細胞數(shù)目、細胞培養(yǎng)時間等的不同而存在差異，本圖僅供參考。
圖3. 發(fā)光法3D細胞活力檢測試劑盒和國外同類產(chǎn)品(Competitor P)對ATP標準品和3D細胞的檢測效果。圖A為本產(chǎn)品和Competitor P對3,000nM和10,000nM ATP標準品的檢測效果對比圖，圖B為5,000和10,000個HCT-116細胞在康寧®球體微孔板培養(yǎng)72小時后用本產(chǎn)品和Competitor P的檢測效果對比圖。實際讀數(shù)會因細胞種類、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
本產(chǎn)品發(fā)光強度高。對于相同種類的細胞樣品，本產(chǎn)品的發(fā)光效果比國外同類產(chǎn)品(Competitor P)強約15-20% (圖3、圖4B)，實測效果會因細胞種類、細胞培養(yǎng)時間等的不同而有所不同。
圖4. 發(fā)光法3D細胞活力檢測試劑盒(C0061)和國外同類產(chǎn)品(Competitor P)對不同數(shù)量HCT-116細胞在康寧®球體微孔板中的檢測效果。不同數(shù)量HCT-116細胞在康寧®球體微孔板中培養(yǎng)72小后用本產(chǎn)品和Competitor P檢測細胞活性。圖A為不同數(shù)量HCT-116細胞培養(yǎng)24、48和72小時的細胞狀態(tài)圖，圖B為本產(chǎn)品和Competitor P對培養(yǎng)72小時后的3D細胞活性檢測效果對比圖，圖C為本產(chǎn)品和Competitor P對10,000個HCT-116細胞培養(yǎng)72小時后的化學(xué)發(fā)光穩(wěn)定性的檢測效果對比圖。實際讀數(shù)會因細胞種類、細胞培養(yǎng)時間、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
本產(chǎn)品檢測靈敏度高，測定樣品的線性范圍寬。使用本產(chǎn)品檢測在康寧®球體微孔板培養(yǎng)72小時的HCT-116細胞活性，細胞種板量僅為10個/孔時，發(fā)光強度即可達空白孔的5倍左右，檢測靈敏度特別高。在發(fā)光強度與細胞數(shù)量之間的線性關(guān)系上，對于3D培養(yǎng)的細胞，接觸抑制對細胞增殖產(chǎn)生的影響以及大型細胞球狀體中央?yún)^(qū)域代謝活性降低或者細胞壞死的影響，會導(dǎo)致細胞接種培養(yǎng)數(shù)天后進行活力測定的化學(xué)發(fā)光信號強度和細胞的接種數(shù)量之間的關(guān)系通常為曲線，但是發(fā)光信號的強度會隨著種板細胞數(shù)量的增加而升高(圖4B)。
本產(chǎn)品穩(wěn)定性好。本試劑盒中的發(fā)光法3D檢測試劑穩(wěn)定性好，反復(fù)凍融5次對檢測效果基本無影響，反復(fù)凍融10次檢測效果下降不超過10%。本產(chǎn)品4℃保存3天對檢測效果無顯著影響，4℃保存7天檢測效果下降不超過10%。室溫保存1天，仍可保留80%以上的檢測效果。37℃保存1天，可保持60%以上的檢測效果。
本產(chǎn)品使用靈活便捷。本產(chǎn)品不僅適合少量樣品的檢測，也非常適合大量樣品的高通量篩選(High-throughput screening)檢測，可用于各種培養(yǎng)方法培養(yǎng)出的3D細胞球，包括細胞懸滴培養(yǎng)板、超低吸附細胞培養(yǎng)板、Matrix-Gel™基質(zhì)膠或Matrigel包被的平板、瓊脂糖包被的平板等。
對于96孔板，推薦使用100μl細胞培養(yǎng)液和100μl的檢測試劑，總體積為200μl，此時本產(chǎn)品每10ml可以進行100次檢測。對于384孔板，推薦使用25μl細胞培養(yǎng)液和25μl的檢測試劑，總體積為50μl，此時本產(chǎn)品每10ml可以進行400次檢測。也可以用其它體積的試劑進行檢測，但細胞培養(yǎng)液和檢測試劑體積的比例須為1:1。
保存條件：
-20℃避光保存，至少一年有效。 -80℃避光保存，可以保存更長時間。
注意事項：
本產(chǎn)品在-20℃保存其檢測效果會逐漸下降，保存一年后其發(fā)光效果會降低約40%。因此，如果希望本產(chǎn)品的發(fā)光效果更加穩(wěn)定，推薦在-80℃避光保存。如果訂購后可能放置較長時間后再使用，推薦訂購在-20℃保存非常穩(wěn)定
螢光素酶的活性對溫度比較敏感，因此反應(yīng)前細胞和檢測試劑均需平衡至室溫后再進行測定�？蓪z測試劑在不超過25℃的室溫或20-25℃的水浴中融解并混勻后使用。溫度的高低會影響化學(xué)發(fā)光的信號強度和信號穩(wěn)定性。
本試劑盒的檢測試劑中含有螢光素酶，反復(fù)凍融會導(dǎo)致其逐漸失活。盡管經(jīng)測試本試劑反復(fù)凍融5次對于其檢測效果無顯著影響，為取得良好的使用效果，第一次解凍后可適當(dāng)分裝保存，但需注意分裝的容器不能有ATP污染。反復(fù)凍融過程中，可能會導(dǎo)致檢測試劑中出現(xiàn)少量沉淀，此時宜平衡至室溫，并盡量溶解。如仍有殘留的不溶物，可以離心去除后使用，經(jīng)測試不會影響后續(xù)的檢測效果。
待測藥物的溶劑含量較高時可能會干擾螢光素酶反應(yīng)，從而影響化學(xué)發(fā)光信號�？梢酝ㄟ^設(shè)置含有溶劑的細胞培養(yǎng)液對照孔排除溶劑的干擾。經(jīng)測試，最終反應(yīng)體系中DMSO含量在2%以內(nèi)不會對反應(yīng)產(chǎn)生影響。
檢測時需使用白色或黑色的96孔板或384孔板。如果使用普通透明的96孔板或384孔板，相鄰孔之間會產(chǎn)生相互干擾。也可使用專為3D培養(yǎng)的超低吸附培養(yǎng)皿或多孔板培養(yǎng)好3D細胞后，轉(zhuǎn)移至普通的白色或黑色多孔板中進行檢測。提供各種超低吸附培養(yǎng)皿或多孔板及普通白色或黑色多孔板，詳見相關(guān)產(chǎn)品。
使用說明中提供了檢測ATP標準品的方法，實際檢測細胞活力時通常并不需要檢測ATP標準品。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
