| 產(chǎn)品編號 | 產(chǎn)品名稱 | 產(chǎn)品包裝 | |
| T100035-0.1ml | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 10mM×0.1ml | |
| T100035-1mg | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 1mg | |
| T100035-5mg | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 5mg | |
| T100035-25mg | Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針 | 25mg |
衰老細胞近紅外熒光探針(Senescence-Tracker™ Near-infrared, Senescence-Tracker™ NIR)，是一種新型的可用于體內(nèi)或體外高亮度、高穩(wěn)定性、高特異性、高生物安全性地檢測衰老細胞(Senescent cells, SnCs)的近紅外熒光探針。Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針能夠被衰老細胞特異性表達的β-半乳糖苷酶(β-galactosidase, β-gal)特異識別并快速酶解，產(chǎn)生強烈的近紅外熒光信號。
本探針中國授權(quán)專利號為ZL202211569064.4，相關(guān)研究成果發(fā)表在國際衰老研究領(lǐng)域著名期刊Aging Cell (2023. 22(8):e13896)。
絕大多數(shù)正常細胞被認為僅具備有限的分裂能力，在停止分裂后就會逐漸進入衰老(Senescence)狀態(tài)。此時細胞仍然是存活的，但細胞的基因和蛋白的表達譜發(fā)生了巨大改變。衰老細胞不能再發(fā)生有絲分裂，并且衰老細胞的細胞周期分布也比較特殊，不同于某些損傷誘導(dǎo)的細胞休眠(Dormancy)，也不同于細胞生長接觸抑制產(chǎn)生的細胞靜默(Quiescence)。細胞衰老被認為是生物體抑制腫瘤的一種方式，但累積的衰老細胞同時也是生物體老化(Aging)的直接原因[2,3]。追蹤衰老細胞通常依賴于檢測衰老細胞的標(biāo)記物和表型特征，如細胞周期抑制蛋白p16和p21、衰老相關(guān)分泌表型(Senescent associated secretory phenotype, SASP)和衰老相關(guān)的β-gal (Senescence-associated β-gal, SA-β-gal) [4-6]。其中，SA-β-gal是最為廣泛接受和使用的細胞衰老生物標(biāo)志物。
Senescence-Tracker™衰老細胞近紅外熒光探針(Senescence-Tracker™ NIR)，又稱XZ1208，CAS號為3026598-16-0，分子式為C34H29N3O9，分子量為623.62，主要由3部分結(jié)構(gòu)組成：DCM (Dicyanomethylene-4H-pyran)-衍生的NIR熒光團、β-Gal殘基和自裂解連接子(Self-immolative linker)。Senescence-Tracker™ NIR進入衰老細胞后，糖苷鍵被細胞內(nèi)β-gal快速切割斷裂，隨后Senescence-Tracker™ NIR 的自裂解部分轉(zhuǎn)化為亞甲基苯醌(Quinone methides, QMs)，并最終激活NIR熒光團，產(chǎn)生強烈的熒光信號，最大激發(fā)波長為490 nm，最大發(fā)射波長為760nm，可根據(jù)儀器的差異適當(dāng)優(yōu)化波長(可參照圖1優(yōu)化)。
本探針特異性強、靈敏度高。本探針僅染色衰老細胞，不會染色衰老前的細胞(Presenescent cells)、靜止期細胞(Quiescent cells)和大部分永生細胞(Immortal cells)；本探針在非衰老細胞和年輕小鼠中幾乎檢測不到熒光，但在衰老細胞和老年小鼠中可以檢測到顯著的熒光信號
本探針可應(yīng)用于活體成像，組織穿透能力強，具有更低的本底熒光。常規(guī)的β-Gal熒光成像探針激發(fā)和發(fā)射的波長主要位于可見光范圍，生物組織的吸收、散射以及自發(fā)熒光干擾導(dǎo)致背景信號高、組織穿透力差，限制了這些探針體內(nèi)成像的應(yīng)用。而本探針的發(fā)射波長位于近紅外(Near-infrared, NIR)窗口，具有很好的組織穿透力、較低的背景熒光和生物損傷。
本探針穩(wěn)定性好、追蹤間長、工作濃度低。經(jīng)測試，在多種方式誘導(dǎo)衰老的人胚胎肺成纖維細胞(Human embryonic lung fibroblasts, HELF)和衰老的人真皮成纖維細胞(Human dermal fibroblasts, HDF)中，本探針染色細胞后約2小時，就可以迅速被切割并產(chǎn)生明顯的熒光，熒光信號約24小時后達到峰值，48小時仍能基本保持穩(wěn)定；10μM的本探針處理HELF和HDF細胞48小時后換液，6天后細胞內(nèi)仍可檢測到熒光信號；低至0.5μM的本探針即可有效標(biāo)記衰老細胞；在小鼠模型中，尾靜脈注射低至5μM的本探針100μl，即可實現(xiàn)活體內(nèi)實時檢測衰老程度，探針在1-2小時內(nèi)能被完全激活，并顯示出非常強的熒光信號，標(biāo)記效應(yīng)可持續(xù)至少6天[1]。
本探針生物安全性高。經(jīng)測試本探針在體外和體內(nèi)模型，特別是多種衰老和衰老相關(guān)疾病模型(衰老、衰老相關(guān)纖維化、創(chuàng)面愈合)中無明顯毒性，可長期且安全地追蹤衰老細胞。用高達50μM的本探針孵育HELF和HDF細胞3天，細胞活力未見影響；給小鼠注射高劑量(10μM)的本探針，并在第7天檢測了血細胞組成、血漿生化指標(biāo)和組織形態(tài)。結(jié)果顯示，經(jīng)本探針處理的小鼠各項指標(biāo)與對照組均無差異[1]。
本探針操作簡單，使用方便。常規(guī)的β-gal檢測法方法是基于β-gal催化X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indolyl β-D-galactopyranoside)生成深藍色產(chǎn)物，如的細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒、溶酶體β-半乳糖苷酶染色試劑盒。細胞衰老β-半乳糖苷酶染色試劑盒方法注意事項繁多、實驗器具要求高、操作相對復(fù)雜，并無法進行活細胞或活體檢測。其它一些針對β-gal檢測方法雖然簡化了操作，使用更為便捷，但仍需要事先固定或者裂解細胞。而本探針可通過被動運輸穿過細胞膜，使用時，細胞水平只需進行簡單共孵育培養(yǎng)，小鼠模型只需進行尾靜脈注射即可，操作非常簡單，無需對細胞進行固定或裂解，可實時檢測活細胞的衰老或活體小鼠中的衰老細胞。
Senescence-Tracker™ NIR對衰老細胞和小鼠的染色、成像效果參考圖1。
圖1.衰老細胞近紅外熒光探針對體外和體內(nèi)衰老細胞的染色效果圖。正常(Untreated)和經(jīng)X光照射(X-ray treated)誘導(dǎo)衰老的HELF細胞(人胚胎肺成纖維細胞)的檢測效果見圖A (激發(fā)波長595nm，檢測波長650-701nm)；3個月齡年輕小鼠及20個月齡衰老小鼠的成像效果見圖B (激發(fā)波長436-500nm，檢測波長570-700nm)�？筛鶕�(jù)儀器的差異適當(dāng)優(yōu)化波長。實際檢測效果會因?qū)嶒灄l件、檢測儀器等的不同而存在差異，圖中數(shù)據(jù)僅供參考。
本探針提供10mM溶液裝和粉末裝。10mM溶液裝配制在DMSO中，每0.1ml可以配制約100ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)；每1mg粉末可以配制約160ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)。
保存條件：-20℃避光保存，至少兩年有效；粉末裝4℃避光保存，至少一年有效；室溫避光保存，至少一個月有效。
注意事項：
本探針為專利化合物，中國授權(quán)專利號為ZL202211569064.4，嚴禁侵權(quán)。如使用本探針發(fā)表論文等，請引用：Aging Cell. 2023. 22(8):e13896
本探針已經(jīng)在衰老細胞(肺和皮膚來源的成纖維細胞)、自然衰老小鼠、輻照小鼠和皮膚損傷等模型中進行過驗證。在應(yīng)用于其它衰老細胞相關(guān)的模型時，需要進行相應(yīng)的優(yōu)化以驗證探針效果。
須使用可以檢測近紅外熒光探針的激光共聚焦顯微鏡、熒光顯微鏡等熒光檢測設(shè)備用于衰老細胞的檢測；須使用可以檢測近紅外熒光探針的活體成像設(shè)備進行小鼠等活體的衰老細胞檢測。
初次使用時可適當(dāng)分裝，避免反復(fù)凍融。
對于微量的液體，每次使用前先離心數(shù)秒鐘，使液體充分沉降到管底。
對于細胞染色，建議染色完成后立即進行觀測；如果條件限制，請避光4℃保存，并在24小時內(nèi)進行檢測，放置時間過久可能會導(dǎo)致熒光部分猝滅。
熒光染料均存在淬滅問題，請盡量注意避光，以減緩熒光淬滅。
本產(chǎn)品僅限于專業(yè)人員的科學(xué)研究用，不得用于臨床診斷或治療，不得用于食品或藥品，不得存放于普通住宅內(nèi)。
為了您的安全和健康，請穿實驗服并戴一次性手套操作。
使用說明：
1.Senescence-Tracker™ NIR儲存液(10mM)的配制：
每1mg Senescence-Tracker™ NIR粉末加入160μl的無水DMSO (ST038)，充分溶解后，得到濃度為10mM的Senescence-Tracker™ NIR儲存液。適當(dāng)分裝后避光保存于-20ºC或更低溫度。
注：本探針10mM溶液裝無須配制，可直接用于Senescence-Tracker™ NIR染色工作液的配制。
2.Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)或注射液(100μM)的配制：
a.染色工作液(10μM)的配制(用于細胞染色)：
(a)根據(jù)樣品數(shù)量及每個樣品所需的Senescence-Tracker™ NIR染色工作液的體積，取一定量Senescence-Tracker™ NIR儲存液(10mM)按照1:1000的比例加入到細胞培養(yǎng)液(含10% FBS)中，使最終濃度為10μM。例如取1µl Senescence-Tracker™ NIR儲存液(10mM)加入到1ml細胞培養(yǎng)液(含10% FBS)中，混勻后即為1ml 10μM的Senescence-Tracker™ NIR染色工作液。
(b)Senescence-Tracker™ NIR染色工作液(10μM)須現(xiàn)配現(xiàn)用。
注：染色工作液中Senescence-Tracker™ NIR的濃度可以根據(jù)實際情況進行適當(dāng)調(diào)整。為降低非特異性熒光染色，在染色效果可以接受的范圍內(nèi)，建議盡量使用較低濃度的Senescence-Tracker™ NIR。
b.注射液(100μM)的配制(用于小鼠等注射)：
(a)按照1:2:97的比例混合Senescence-Tracker™ NIR儲存液(步驟1配制)、2% Tween-80和生理鹽水(ST341)，例如取10μl Senescence-Tracker™ NIR儲存液和20μl 2% Tween-80加入970μl生理鹽水中，混勻即得1ml 100μM的Senescence-Tracker™ NIR注射液。
(b)Senescence-Tracker™ NIR注射液(100μM)須現(xiàn)配現(xiàn)用。
3.對于懸浮細胞：
a.細胞按照實驗設(shè)計進行一定處理后，計數(shù)。取適當(dāng)細胞600×g室溫離心5分鐘，棄上清，加入適當(dāng)體積的Senescence-Tracker™ NIR染色工作液重懸細胞，使細胞密度為100萬-2000萬/ml。
b.細胞培養(yǎng)箱中37ºC孵育24小時，不同的細胞最佳孵育時間不同。以24小時作為初始孵育時間，根據(jù)實際檢測效果對孵育時間進行適當(dāng)優(yōu)化以得到更佳的檢測效果。
c.37ºC孵育結(jié)束后，600×g 4ºC離心3-4分鐘，沉淀細胞。棄上清，注意盡量不要吸除細胞。
d.加入1ml PBS洗滌細胞，600×g 4ºC離心3-4分鐘，沉淀細胞，棄上清。重復(fù)洗滌2次。
e.再用適量PBS重懸后，用熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡觀察，也可以用熒光酶標(biāo)儀檢測或流式細胞儀分析。
注：如果需要在載玻片或蓋玻片上固定懸浮細胞，可選用Poly-D-lysine/多聚賴氨酸(ST508)處理載玻片或蓋玻片。
4.對于貼壁細胞：
本步驟以6孔板為例。其它孔板檢測試劑的用量參考6孔板的用量進行適當(dāng)調(diào)整。
a.吸除培養(yǎng)液，PBS洗滌1次。
b.每孔加入1ml Senescence-Tracker™ NIR染色工作液。細胞培養(yǎng)箱中37ºC孵育24小時，不同的細胞最佳孵育時間不同。以24小時作為初始孵育時間，根據(jù)實際檢測效果對孵育時間進行適當(dāng)優(yōu)化以得到更佳的效果。
c.37ºC孵育結(jié)束后，吸除上清，用PBS洗滌3次。
d.每孔加入1ml PBS，熒光顯微鏡或激光共聚焦顯微鏡下觀察。HELF細胞的檢測效果見圖1A。
注1：如果希望采用流式細胞儀檢測，可以收集細胞，PBS重懸后進行檢測。
注2：如果細胞貼壁不太好，可沿著孔板壁緩慢加入溶液，然后輕輕混勻，以避免細胞被沖散。
5.對于小鼠：
a.每只小鼠尾靜脈注射100μl Senescence-Tracker™ NIR注射液(100μM)。按照小鼠約2ml血液來計算，Senescence-Tracker™ NIR在血液中的粗略終濃度約為5μM。
b.24小時后麻醉小鼠并進行活體成像 (In vivo imaging systems, IVIS)。3個月年輕小鼠及20個月衰老小鼠的成像效果見圖1B。
注：小鼠Senescence-Tracker™ NIR注射液的濃度通�？梢栽�50-300μM范圍內(nèi)適當(dāng)調(diào)整；體內(nèi)的示蹤時間可根據(jù)實驗需要大致在1-6天內(nèi)進行適當(dāng)調(diào)整。
參考文獻：
1.Hu L, Dong C, Wang Z, He S, Yang Y, et al. Aging Cell. 2023. 22(8):e13896.
2.Baker DJ, Childs BG, Durik M, Wijers ME, Sieben CJ, et al. Nature. 2016. 530(7589):184-9.
3.Baker DJ, Wijshake T, Tchkonia T, LeBrasseur NK, Childs BG, et al. Nature. 2011. 479(7372):232-6.
4.Huang W, Hickson LJ, Eirin A, Kirkland JL, Lerman LO. Nat Rev Nephrol. 2022. 18(10):611-627.
5.Birch J, Gil J. Genes Dev. 2020. 34(23-24):1565-1576.
6.Itahana K, Campisi J, Dimri GP. Methods Mol Biol. 2007. 371:21-31.
