注    意：正式測(cè)定之前選擇2-3個(gè)預(yù)期差異大的樣本做預(yù)測(cè)定。

測(cè)定意義：

細(xì)胞色素P450酶是一組主要存在于肝臟的酶系，在外源物質(zhì)代謝中，尤其是藥物和毒物的代謝，具有重要作用。ERND在P450酶系中相當(dāng)于CYP2B亞型，與藥物代謝的去甲基化密切相關(guān)。CYP2B具有催化底物形成非活性易于排泄的代謝產(chǎn)物而具有解毒作用，也可使某些藥物經(jīng)CYP2B代謝活化。

測(cè)定原理：

ERND催化紅霉素釋放甲醛，通過(guò)Nash比色測(cè)定甲醛含量，即可計(jì)算出ERND活性。

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、普通離心機(jī)，超速離心機(jī)、可調(diào)式移液槍、1mL玻璃比色皿、蒸餾水和冰。

試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加50 mL蒸餾水溶解。

試劑二：液體×1瓶，4℃保存。

試劑三：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2.6 mL蒸餾水，充分溶解。

試劑四：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前加2.6 mL蒸餾水，充分溶解。

試劑五：粉劑×1瓶，4℃保存。臨用前，加蒸餾水9 mL充分溶解。

試劑六：液體×1瓶，4℃保存。

試劑七：液體×1瓶，4℃保存。

標(biāo)準(zhǔn)液：液體×1瓶，-20℃保存。臨用前取1.5 mL EP 管，加入10μl標(biāo)準(zhǔn)液，加990μl蒸餾水，混勻即為0.05 mmol/L標(biāo)準(zhǔn)甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提�。�

1、除去細(xì)胞核，線粒體等大分子物質(zhì)：稱約0.5g組織，加入1mL試劑一，冰上充分研磨，10 000g 4℃離心30min，取上清液，轉(zhuǎn)入超速離心管中。

2、粗制微粒體：100 000g，4℃，離心60min，棄上清液。

3、除血紅蛋白等雜質(zhì)：向步驟2的沉淀中加1mL試劑一，蓋緊后充分震蕩溶解，100 000g離心30min，棄上清液。

4、最終微粒體：向步驟3的沉淀中加試劑二0.5mL，充分震蕩溶解，即粗酶液，待測(cè)。該待測(cè)液需當(dāng)天使用。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)預(yù)熱30 min以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到412 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二置于37℃水浴中預(yù)熱30 min。

3. 對(duì)照管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL蒸餾水，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取新的EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃

水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A對(duì)照管。

4. 測(cè)定管：取1支EP管，加入50μL粗酶液，850μL試劑二，50μL試劑三，50μL試劑四，混勻后置于37℃水浴保溫30min；立即加入175μL試劑五，混勻后置于冰浴中5min；取出后加入175μL試劑六，混勻后室溫靜置5min；室溫8000rpm離心5min；取1支新EP管，加入500μL上清液，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A測(cè)定管。

5. 標(biāo)準(zhǔn)管：取1支EP管，加入500μL標(biāo)準(zhǔn)品，500μL試劑七，混勻后60℃水浴10min，然后取出，用冷水冷卻5min，于412nm測(cè)定光吸收，記為A標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：每個(gè)樣品都需要做對(duì)照管。

ERND活性計(jì)算公式：

(1) 按照蛋白濃度計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每毫克蛋白催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。

ERND活性(nmol/min/mg prot) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（Cpr×V樣）÷T

= 45×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷Cpr。

(2). 按照樣本質(zhì)量計(jì)算:

活性單位定義：37℃下，每分鐘每克樣品催化產(chǎn)生1nmol甲醛為1個(gè)酶活單位。

ERND活性(nmol/min/g 鮮重) = C標(biāo)準(zhǔn)品×V標(biāo)準(zhǔn)品×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管×稀釋倍數(shù)÷（W×V樣）÷T

= 45×（A測(cè)定管－A對(duì)照管）÷A標(biāo)準(zhǔn)管÷W

C標(biāo)準(zhǔn)品：0.05 mmol/L=50μmol/L；V標(biāo)準(zhǔn)品：500μL=0.0005 L；稀釋倍數(shù)：V反總÷V上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度，mg/mL，需要另外測(cè)定，建議使用本公司BCA蛋白質(zhì)含量測(cè)定試劑盒；V樣：加入粗酶液體積，50μL=0.05mL；W：樣本質(zhì)量，g；T：催化反應(yīng)時(shí)間，30min。