所需儀器耗材及試劑: 含 500nm 波長的分光光度計及 1cm 光徑比色皿(或酶標 儀及 96 孔板),37℃水浴鍋,臺式低速離心機,各種規(guī)格移 液器,蒸餾水,渦旋混勻器,試管或離心管。
操作過程:
1、樣本處理: ①、血清(漿):直接測定,如超過線性范圍用生理鹽水稀 釋后測定。
②、培養(yǎng)液樣本:吸取培養(yǎng)液,1000 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分 鐘,取上清測定。[注]:一般建議細胞密度在 100 萬個/mL 以上。
③、組織樣本:準確稱取組織重量,按重量(g):體積 (mL)=1:9 的比例,加入 9 倍體積的勻漿介質(zhì),冰水 浴條件下機械勻漿,2500 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,取 上清液待測。[注]:如組織樣本均為非高脂樣本,勻 漿介質(zhì)統(tǒng)一用磷酸鹽緩沖液(0.1mol/L pH 7.4)或生 理鹽水進行勻漿提。蝗缃M織樣本均為高脂樣本或 部分為高脂樣本,勻漿介質(zhì)可統(tǒng)一用無水乙醇進行 勻漿提取。
④、細胞樣本: A、細胞收集:將制備好的細胞懸液取出,1000 轉(zhuǎn)/分, 離心 10 分鐘,棄上清液,留細胞沉淀;用等滲緩沖 液(推薦 0.1mol/L、pH7~7.4 磷酸鹽緩沖液)清洗 1~2 次,同樣 1000 轉(zhuǎn)/分,離心 10 分鐘,棄上清液, 留細胞沉淀; B、細胞破碎:加入 0.2~0.3mL 的勻漿介質(zhì)(推薦 0.1mol/L、pH7~7.4 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水)進 行勻漿,冰水浴條件下超聲破碎(功率 300W,3~5 秒/次,間隔 30 秒,重復(fù) 3~5 次)或手動勻漿,制備好 的勻漿液不離心直接測定。也可采用裂解液裂解(推 薦 TritonX-100,1~2%,裂解 30~40 分鐘),裂解好的 液體不離心直接測定。 [注]:建議收集的細胞密度在 100 萬個/mL 以上。破碎 好的液體可顯微鏡觀察細胞是否破碎完全。
性能指標: 1、試劑空白管吸光度≤0.100(光徑 0.5cm)。
2、線性:0~19.39mmol/L 范圍內(nèi),r 2>0.995。
3、精密度:CV≤3%,批間相對極差≤5%。
4、穩(wěn)定性:原裝試劑盒在 2℃~8℃避光保存,有效期為 12 個月。開啟后 2℃~8℃避光保存,可穩(wěn)定 3 個月。
注意事項:
1、本產(chǎn)品僅用于科研,不得用于臨床診斷,切勿服用。
2、樣品含量如超出檢測范圍上限時,可用生理鹽水稀釋樣本 后進行測定,測定結(jié)果乘以稀釋倍數(shù)。
3、試劑防止葡萄糖、膽固醇等試劑的污染。
4、試劑與樣本量可按照全自動生化分析儀的要求,按照 1: 100 的比例增減。
5、標準品為醇溶性試劑,打開后易揮發(fā),96 管板操作時盡量 在加完樣本后加標準品,且標準管優(yōu)先加入工作液以降低 標準品的揮發(fā),從而降低偏差。
參考文獻: 1、Searay R .L.Diagonstic Biochemistry. Mc Graw-Hill . New York. NY.1969 2、Richmand W.Clin.Chem.1973;19:1350