1 原理及用途
恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（飼料專用）采用間接競爭ELISA方法檢測飼料樣本中的恩諾沙星（Enrofloxacin，ENR），試劑盒由預包被偶聯(lián)抗原的酶標板、辣根酶標記物、抗體、標準品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標準品或樣品溶液，樣本中的恩諾沙星和酶標板上預包被偶聯(lián)抗原競爭抗恩諾沙星抗體，加入酶標記物后，用TMB底物顯色，樣本吸光度值與其所含恩諾沙星含量成負相關，與標準曲線比較即可得出樣本中恩諾沙星的殘留量。
2 技術指標
2.1 試劑盒靈敏度：0.1ppb(ng/ml)
2.2 反應模式：25℃，45min～15min
2.3 檢測下限：
飼料……………………………………8ppb
2.4 交叉反應率：
恩諾沙星………………………………100%
噁喹酸…………………………………28%
左氧氟沙星……………………………10%
洛美沙星………………………………4%
麻保沙星………………………………4%
沙拉沙星………………………………2%
2.5 樣本回收率：
飼料……………………………………85%±15%
3 恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（飼料專用）恩諾沙星酶聯(lián)免疫檢測試劑盒（飼料專用）組成
酶標板……………………………96孔
標準液：各1ml
0ppb、0.1ppb、0.3 ppb、0.9ppb、2.7ppb、8.1ppb
高標準液（紅蓋）：1ppm …………1ml
酶標記物（紅蓋）……………………5.5ml
抗體工作液（藍蓋）…………………5.5ml
底物液A（白蓋）……………………6ml
底物液B（黑蓋）……………………6ml
終止液（黃蓋）………………………6ml
20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml
5×復溶液（黃蓋）…………………50ml
說明書…………………………………1份
蓋板膜…………………………………1張
自封袋…………………………………1個
4 需要的器材和試劑
4.1 儀器：酶標儀、打印機、均質器 、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）
4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl
4.3 試劑：無水乙腈、正己烷、濃HCl
5 樣本前處理
5.1 樣本處理前須知：
實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結果。
5.2 配液：
配液1：0.15M鹽酸溶液
取5ml濃鹽酸，加入去離子水混勻，定容至400ml。
配液2：樣本提取液
量取10ml 0.15M鹽酸溶液（配液1）加入到90ml無水乙腈中混合均勻。
配液3：復溶液
將5×復溶液用去離子水5倍稀釋（1份復溶液加4份去離子水），用于樣本的復溶，復溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。
配液4:工作洗滌液
將濃縮洗滌液20倍稀釋(1份洗滌液加19份去離子水)。
5.3 樣本前處理步驟：
5.3.1 飼料處理方法
1）稱取1.0±0.05g 粉碎后飼料樣本于50ml離心管中；
2）加入8ml樣本提取液（配液2），振蕩5分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；
3）取2ml清澈上層有機相至潔凈干燥的10ml玻璃試管中，50-60℃水浴氮氣吹干；
4）加入2ml正己烷，振蕩30s，再加2ml復溶液（配液3），振蕩2分鐘，室溫4000轉/分離心10分鐘；
5）去除上層正己烷，取最下層清澈水相50µl于1.5ml離心管中，再加入450ul復溶液（配液3），振蕩混勻30s，取50ul分析。
樣本稀釋倍數：80 檢測下限：8ppb
6 酶聯(lián)免疫試驗步驟
將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結晶需恢復到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。
6.1 編 號：將樣本和標準品對應微孔按序編號，每個樣本和標準品做2孔平行，并記錄標準孔和樣本孔所在的位置。
6.2 加樣反應：加標準品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標記物50µl/孔，再加入50µl/孔的抗體工作液，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，25℃反應45分鐘。
6.3 洗 滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。
6.4 顯 色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，25℃避光顯色15分鐘（若藍色過淺，可適當延長反應時間）。
6.5 終 止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應。
6.6 測吸光值：用酶標儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應在終止反應后10分鐘內完成。
7 結果分析
7.1 百分吸光率的計算
