1 原理及用途

甲氧芐氨嘧啶酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒采用競爭ELISA方法檢測組織、飼料、尿樣和血清等樣本中的甲氧芐氨嘧啶（Trimethoprim，TMP），試劑盒由預(yù)包被甲氧芐氨嘧啶抗體的酶標(biāo)板、TMP酶標(biāo)記物、標(biāo)準(zhǔn)品及其他配套試劑組成。檢測時，加入標(biāo)準(zhǔn)品或樣本溶液，樣本中的甲氧芐氨嘧啶和TMP酶標(biāo)記物競爭酶標(biāo)板上預(yù)包被的甲氧芐氨嘧啶抗體，用TMB底物顯色后，樣本吸光度值與樣本甲氧芐氨嘧啶含量成負(fù)相關(guān)，與標(biāo)準(zhǔn)曲線比較即可得出樣本中甲氧芐氨嘧啶的殘留量。

2 技術(shù)指標(biāo)

2.1 試劑盒靈敏度：0.03ppb(ng/ml)

2.2 反應(yīng)模式：37℃，45min～15min

2.3 檢測下限：

飼料……………………………………1.6ppb

組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………0.4ppb

血清/尿液/血漿………………………0.3ppb

雞蛋……………………………………0.3ppb

2.4 交叉反應(yīng)率：

甲氧芐氨嘧啶………………………100%

磺胺吡啶……………………………<0.1%

磺胺…………………………………<0.1%

磺胺嘧啶……………………………<0.1%

磺胺異噁唑…………………………<0.1%

磺胺噻唑……………………………<0.1%

磺胺甲基嘧啶………………………<0.1%

磺胺多辛……………………………<0.1%

 2.5 樣本回收率：

飼料……………………………………95%±15%

組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）………95%±10%

血清/尿液/血漿………………………85%±10%

雞蛋……………………………………85%±15%

3 試劑盒組成

酶標(biāo)板……………………………96孔

標(biāo)準(zhǔn)液（黑蓋）：各1ml

0ppb、0.03ppb、0.09ppb、0.27ppb、0.81ppb、2.43ppb

高標(biāo)準(zhǔn)液：100ppb……………………1ml

酶標(biāo)抗原工作液（紅蓋）……………5.5ml

底物液A（白蓋）……………………6ml

底物液B（黑蓋）……………………6ml

終止液（黃蓋）………………………6ml

2×濃縮復(fù)溶液（黃蓋）……………50ml

20×濃縮洗滌液（白蓋）……………40ml

說明書…………………………………1份

蓋板膜…………………………………1張

自封袋…………………………………1個

4 甲氧芐氨嘧啶酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒需要的器材和試劑

4.1 儀器：酶標(biāo)儀、打印機、均質(zhì)器、氮氣吹干裝置、振蕩器、離心機、刻度移液管、天平（感量0.01g）

4.2 微量移液器：單道20µl-200µl，100µl-1000µl、多道300µl

4.3 試劑：無水甲醇、正己烷、濃鹽酸、氫氧化鈉、乙腈

5 樣本前處理

5.1 樣本處理前須知：

實驗器具必須潔凈并使用一次性吸頭，以避免污染干擾實驗結(jié)果。

5.2 配液：

配液1：復(fù)溶液

    將2×濃縮復(fù)溶液用去離子水2倍稀釋（1份2×濃縮復(fù)溶液加1份去離子水）,用于樣本的復(fù)溶，復(fù)溶液在4℃環(huán)境可保存一個月。

配液2：0.1M 鹽酸溶液

    取濃鹽酸10ml加入去離子水混勻，定容至1200ml。

配液3：1M 氫氧化鈉溶液

稱取4g 氫氧化鈉加入去離子水混勻溶解，定容至100ml。

配液4：工作洗滌液

    將20×濃縮洗滌液20倍稀釋(1份20×濃縮洗滌液加19份去離子水)。

5.3 樣本前處理步驟：

5.3.1 飼料處理方法 

1）稱取2g±0.05g粉碎樣本于50ml離心管中，加20ml 0.1M鹽酸溶液（配液2），振蕩15min，室溫4000r/min離心10min；

2）取1ml上清到1.5ml離心管，加入70ul 1M氫氧化鈉溶液（配液3）調(diào)節(jié)PH值到6-8，混勻（針對不同的飼料樣本可以調(diào)節(jié)1M氫氧化鈉溶液的用量），室溫4000r/min離心10min；

3）取0.5ml上清到另一1.5ml離心管，加入0.5ml的復(fù)溶液（配液1），混勻；

3）取50μl進行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：20    檢測下限：1.6ppb

5.3.2 組織（魚/蝦/肉/肝臟/腎臟）處理方法 

1）取除去脂肪的勻漿組織2g±0.05g于50ml離心管中，加入6ml無水甲醇和2ml正己烷，最大速度渦旋振蕩5min；

2）室溫4000r/min離心10min，去除上層正己烷層，移取0.5ml下層清液到潔凈玻璃試管（避免觸碰脂肪層）；

3）在50-60℃下氮氣或空氣吹干；

4）加入400ul的復(fù)溶液（配液1）和500ul正己烷，最大速度渦旋振蕩1min；

5）轉(zhuǎn)入1.5ml離心管，室溫4000r/min離心5min，去除上層正己烷層，移取50ul下層清液進行分析。

    樣本稀釋倍數(shù)：5    檢測下限：0.4ppb

5.3.3 尿液/血清/血漿處理方法

1）取0.5ml樣本，室溫4000r/min離心5min；

2）取50µl上清液，加入450µl復(fù)溶液（配液1），混勻；

3）取50µl用于檢測。

    樣本稀釋倍數(shù)：10    檢測下限：0.3ppb

（如果需要，可以加大 復(fù)溶液的用量來加大稀釋倍數(shù)）

5.3.4 雞蛋樣本處理方法

1）用均質(zhì)器均質(zhì)雞蛋樣本，使蛋清和蛋黃充分混合；

2）稱取2g±0.05g均質(zhì)后的雞蛋樣本（蛋粉1g加3ml去離子水混勻后取2ml相當(dāng)于2g鮮雞蛋）至50ml離心管中，加入8ml乙腈，立即用振蕩器振蕩10min，室溫4000r/min離心5min；

3）移取1ml上清液至10ml潔凈干燥玻璃試管中于，在50-60℃氮氣或空氣吹干；

4）加入1ml正己烷，用渦旋儀渦動30s溶解干燥的殘留物，再加入1ml復(fù)溶液（配液1），用渦旋儀渦動1min，室溫4000r/min以上離心5min；

5）去上層有機相，取下層水相50ul用于分析。

樣本稀釋倍數(shù): 4    檢測下限：0.3ppb

6 酶聯(lián)免疫試驗步驟

    將所需試劑從4℃冷藏環(huán)境中取出，置于室溫平衡30min以上, 洗滌液冷藏時可能會有結(jié)晶需恢復(fù)到室溫以充分溶解，每種液體試劑使用前均須搖勻。取出需要數(shù)量的微孔板及框架，將不用的微孔板放入自封袋，保存于2-8℃。

6.1 編    號：將樣本和標(biāo)準(zhǔn)品對應(yīng)微孔按序編號，每個樣本和標(biāo)準(zhǔn)品做2孔平行，并記錄標(biāo)準(zhǔn)孔和樣本孔所在的位置。

6.2 加樣反應(yīng)：加標(biāo)準(zhǔn)品或樣本50µl/孔到各自的微孔中，然后加酶標(biāo)抗原工作液50µl/孔，用蓋板膜封板，輕輕振蕩5秒混勻，37℃反應(yīng)45min。

6.3 洗    滌：小心揭開蓋板膜，甩去孔內(nèi)液體，每孔加350ul工作洗滌液，靜置30秒后棄去，重復(fù)洗滌5次，最后一次拍干（用吸水紙拍干，拍干后未被清除的氣泡可用干凈的槍頭刺破）。

6.4 顯    色：每孔加入底物液A 50µl，再加底物液B 50µl，輕輕振蕩5秒混勻，37℃避光顯色15min（若藍色過淺，可適當(dāng)延長反應(yīng)時間）。

6.5 終    止：每孔加入終止液50µl，輕輕振蕩混勻，終止反應(yīng)。

6.6 測吸光值：用酶標(biāo)儀于450nm處測定每孔吸光度值（建議用雙波長450/630nm）。測定應(yīng)在終止反應(yīng)后10min內(nèi)完成。

7 結(jié)果分析

7.1 百分吸光率的計算

    標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光率等于標(biāo)準(zhǔn)液或樣本的百分吸光度值的平均值（雙孔）除以第一個標(biāo)準(zhǔn)液（0ppb）的吸光度值，再乘以100%，即

A—標(biāo)準(zhǔn)溶液或樣本溶液的平均吸光度值

A0—0ppb標(biāo)準(zhǔn)溶液的平均吸光度值

7.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制與計算

    以標(biāo)準(zhǔn)液百分吸光率為縱坐標(biāo)，對應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)液濃度（ppb）的對數(shù)為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)液的半對數(shù)曲線圖。將樣本的百分吸光率代入標(biāo)準(zhǔn)曲線中，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀出樣本所對應(yīng)的濃度，乘以其對應(yīng)的稀釋倍數(shù)即為樣本中待測物的實際濃度。

    若利用試劑盒專業(yè)分析軟件進行計算，更便于大量樣本的準(zhǔn)確、快速分析。（歡迎來電索�。�

8 甲氧芐氨嘧啶酶聯(lián)免疫法檢測試劑盒注意事項

8.1 室溫低于25℃或試劑及樣本沒有回到室溫（25℃）會導(dǎo)致所有標(biāo)準(zhǔn)的OD值偏低。

8.2 在洗板過程中如果出現(xiàn)板孔干燥的情況，則會出現(xiàn)標(biāo)準(zhǔn)曲線不成線性，重復(fù)性不好的現(xiàn)象。所以洗板拍干后應(yīng)立即進行下一步操作。

8.3 混合要均勻，洗板要徹底，在ELISA分析中的再現(xiàn)性，很大程度上取決于洗板的一致性。

8.4 在所有孵育過程中，用蓋板膜封住微孔板，避免光線照射。

8.5 不要使用過了有效期的試劑盒，不要交換使用不同批號試劑盒中的試劑。

8.6 顯色液若有任何顏色表明變質(zhì)，應(yīng)當(dāng)棄之。0標(biāo)準(zhǔn)的吸光度值小于0.5個單位（A450nm< 0.5 ）時，表示試劑可能變質(zhì)。

8.7 反應(yīng)終止液有腐蝕性，避免接觸皮膚。

9 貯藏及保存期

儲藏條件：試劑盒于2-8℃保存，避免冷凍。

保 質(zhì) 期：該產(chǎn)品有效期為1年，生產(chǎn)日期見包裝盒。