產(chǎn)品概述：hPSC-心肌細胞是從人類多能干細胞（hPSC）分化得來，該細胞具有搏動能 力，能表達心肌細胞的特異性 Marker（如 cTNT 等）

需要材料：1.DPBS, No Calcium, No Magnesium  2.RPMI1640    3.FBS

細胞傳代：CM 不能增殖，當(dāng)有實驗需求時可按培養(yǎng)器皿底面積 1:1 比例接種傳代

培養(yǎng)操作（以六孔板 1 孔為例）

1）復(fù)蘇細胞：將含有 1 mL 細胞懸液的凍存管在 37℃水浴中迅速搖晃解凍，加 4 mLCM 維持培養(yǎng)基（含 10μM IMC-014-Y）混合均勻。在 1000 rpm 條件下離心 3 min，棄去上

清液，加 1-2 mL CM 維持培養(yǎng)基（含 10μM IMC-014-Y）后混勻。然后將所有細胞懸液加入含適量 CM 維持培養(yǎng)基（含 10μM IMC-014-Y）的基質(zhì)膠包被的六孔板（1 孔）或 35mm 皿

中培養(yǎng)過夜。24h 后，換成不含 IMC-014-Y 的 CM 維持培養(yǎng)基，視培養(yǎng)基顏色或隔 2 天換液。

1、棄去培養(yǎng)基，每孔加入 1mL 心肌細胞消化液（貨號 IMI-M001X），置于 37℃培養(yǎng)箱消化 1-2 h。

2、1-2 h 后每孔加入等量 CM 維持培養(yǎng)基（含 10μM IMC-014-Y），輕輕吹打細胞，使細胞解離成單細胞。

3、將細胞懸液收集到 15 mL 離心管中，室溫下 300 g 離心 5 min。

4、仔細抽吸上清液，不干擾細胞，用 1mL 恢復(fù)室溫的 CM 維持培養(yǎng)基重懸細胞（含 10μM IMC-014-Y），輕輕地上下移液以確保細胞溶液均勻。

5、使用 CM 維持培養(yǎng)基（含 10μM IMC-014-Y）稀釋細胞，將細胞以 1:1 比例接種到基質(zhì)膠包被的六孔板或 35mm 皿中培養(yǎng)過夜（按底面積算，1 個 T25 相當(dāng)于六孔板 2.5 個孔，

六孔板 1 孔可傳 12 孔板的 2 孔，24 孔板的 4 孔，96 孔板的 6 孔）。24h 后，換成不含 IMC014-Y 的 CM 維持培養(yǎng)基，視培養(yǎng)基顏色或隔 2 天換液。

心肌細胞進行再接種:如果需要將心肌細胞按合適密度接種到新的培養(yǎng)皿/瓶中，可對心肌細胞進行再接種，再接種操作會導(dǎo)致20%左右的細胞死亡，即損失20%的細胞。

1.室溫平衡心肌細胞復(fù)蘇液、DPBS溶液，37℃預(yù)熱心肌細胞消化液。

2.取出心肌細胞鋪板液包被過的培養(yǎng)皿/瓶，吸去心肌細胞鋪板液并加入適量心肌細胞復(fù)蘇液，置于5%CO 2 的37℃恒溫細胞培養(yǎng)箱中。

3.吸除心肌細胞培養(yǎng)基，加入DPBS溶液清洗一次。

4.移除DPBS，加入預(yù)熱的心肌細胞消化液使之完全覆蓋皿/瓶底。

5.37℃孵育3-5分鐘，顯微鏡下觀察到大部分細胞相互分離，表明達到理想的消化時間。

6.向皿/瓶中加入消化液3-5倍體積的RPMI1640+10%FBS終止消化，用槍扇形吹打培養(yǎng)皿/瓶底，使皿/瓶底貼附的心肌細胞脫落，將細胞轉(zhuǎn)移至15ml 離心管中，再加入適量中和液沖洗皿/瓶底，收集剩余細胞加入15ml離心管中，300g離心5分鐘。

I .小心移除上清，用心肌細胞復(fù)蘇液重懸細胞，輕柔吹打混勻，并接種到包被過的培養(yǎng)皿/瓶中，十字晃動使細胞均勻分布。

II.5%CO 2 的37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24-48小時后，更換為心肌細胞培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

III.心肌細胞需要在二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)2-8天恢復(fù)搏動；此期間心肌細胞需要每隔48h換一次心肌細胞培養(yǎng)基。

重要提醒：吹打力度要輕柔，避免損傷細胞。亦可用心肌細胞培養(yǎng)基+10%FBS終止消化。

培養(yǎng)材料準(zhǔn)備心肌細胞鋪板液包被培養(yǎng)皿/瓶：在4℃冰面上，往培養(yǎng)皿/瓶中添加心肌細胞鋪板液至完全覆蓋皿/瓶底(建議1ml/六孔板單孔)，37℃包被1小時。如果暫時不用，可用塑封膜封口后2-8℃儲存，并于1周內(nèi)使用，保存期間心肌細胞鋪板液需始終保持完全覆蓋皿底。

重要提醒：操作時需要將鋪板液始終置于冰上；正確操作下鋪板液應(yīng)呈清亮，若操作時間過長或溫度過高，鋪板液會變得粘稠甚至呈膠狀，不宜使用。

心肌細胞復(fù)蘇(適用于凍存的細胞）

1.將心肌細胞復(fù)蘇液從4°C冰箱中取出，室溫平衡30分鐘。

2.打開水浴鍋，設(shè)定溫度為37°C。

3.開啟生物安全柜進行紫外滅菌30分種。

4.在冰上將1ml心肌細胞鋪板液加入6孔板的一個孔中(0.1ml/cm 2 )，隨即前后左右晃動6孔板，使鋪板液均勻覆蓋孔的表面。

5.將剩余鋪板液迅速放回冰箱，將6孔板放入細胞培養(yǎng)箱中孵育1小時。

6.取出孵育好的6孔板，放于生物安全柜中，吸除心肌細胞鋪板液后，立刻在孔內(nèi)加入1ml 心肌細胞復(fù)蘇液。

7.從高效液氮儲存罐中取出需要復(fù)蘇的細胞，將其放于干冰中暫存。

8.從干冰中取出細胞，迅速將凍存管的下1/2沒入水浴鍋中，輕柔晃動1-2分鐘至管中僅剩一小塊冰時，將其取出。

9.75%酒精擦拭凍存管表面后，將其放入生物安全柜中，擰開管蓋，用1ml槍尖輕柔的將管中液體盡可能多的轉(zhuǎn)移至15ml離心管中，用1ml心肌細胞復(fù)蘇液輕柔沖洗凍存管，以5秒鐘一滴的速度將沖洗液緩慢滴加入15ml離心管，邊滴加邊輕柔晃動離心管。

10.再用槍尖以同樣速度，滴加1ml心肌細胞復(fù)蘇液至15ml離心管，邊滴加邊輕柔晃動離心管。

11.用移液管由慢（2秒鐘一滴）到快的滴加9ml心肌細胞復(fù)蘇液，同時輕柔晃動離心管。300g離心5分鐘。

12.在生物安全柜內(nèi)吸除上清，用2ml移液管取1ml心肌細胞復(fù)蘇液輕柔吹打細胞沉淀3-5次后，將其加入6孔板中，前后左右十字晃動混勻（可按比例稀釋計數(shù)）。

13.顯微鏡下觀察，細胞均勻分布。

14.在6孔板上標(biāo)記好細胞名稱、日期以及操作人員后，將其放入細胞培養(yǎng)箱，再次前后左右晃動混勻，放入細胞培養(yǎng)箱種培養(yǎng)24-48小時至絕大多數(shù)細胞貼壁后即可換液為心肌細胞培養(yǎng)基。

重要提醒：心肌細胞復(fù)蘇計數(shù)后，可按需求接種至需要的培養(yǎng)容器；

心肌細胞培養(yǎng)時，按照推薦的密度接種，能夠抑制成纖維細胞生長速度；

重要提醒：心肌細胞復(fù)跳后，建議繼續(xù)培養(yǎng)1-2天穩(wěn)定細胞狀態(tài)。

心肌細胞維持

1.將心肌細胞培養(yǎng)基室溫平衡30分鐘。

2.將心肌細胞用心肌細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)，每48小時換液一次。更換時，貼壁加入培養(yǎng)基避免刮碰細胞；亦可加入標(biāo)準(zhǔn)量150%的心肌細胞培養(yǎng)基，每72小時換液一次。

重要提醒：細胞在6-8周內(nèi)性狀穩(wěn)定。如果需要長期培養(yǎng)，為了維持細胞穩(wěn)定性和純度，需要定 期采用心肌細胞純化液進行處理,一般每6周處理一次