一、產(chǎn)品簡介

hESC/iPSC 細(xì)胞培養(yǎng)基試劑盒是廈門逸漠生物科技有限公司研發(fā)技術(shù)團(tuán)隊(duì)開發(fā)的一種適用于無飼養(yǎng)層培養(yǎng)，成分明確，補(bǔ)充多種生長因子的人多能干細(xì)胞（hPSC）無血清培養(yǎng)體系。hESC/iPSC 在 hESC/iPSC 細(xì)胞培養(yǎng)基中可以快速增殖，而邊緣分化的細(xì)胞則在該培養(yǎng)基中生長較慢，從而選擇性擴(kuò)增并獲得高純度人多能干細(xì)胞。

二、產(chǎn)品信息

表 1： hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基 試劑盒產(chǎn)品內(nèi)容

表 2： hESC/iPSC 其他相關(guān)試劑 產(chǎn)品內(nèi)容

三、試劑材料

表 3：其他試劑&材料

四、 試劑準(zhǔn)備

1 ）hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基配制（500 mL ）

1. 在 4℃條件下解凍 hESC/iPSC Grouth SupplementsA/B，勿在 37℃培養(yǎng)箱/水浴鍋解凍。

2.  在生物安全柜中，使用無菌移液管將 hESC/iPSC Grouth Supplements A/B 與 hESC/iPSC Basal Medium 混勻配制成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后根據(jù)使用情況將培養(yǎng)基分 裝，封口膜封好，確保置于 4℃儲存的培養(yǎng)基 2 周內(nèi)使用完畢，其余培養(yǎng)基于-20℃冷凍保 存，需要時(shí)提前于 4℃過夜解凍。

2 ）Matrigel 鋪板（以  Corning® Matrigel® 包被 6 孔板為例 ）

A. 分裝 Matrigel

1. Matrigel，操作說明中不標(biāo)注蛋白濃度，而是以 Dilution Factor 表示，如某批次的推薦 Dilution Factor 為 278 μL，則表明 278 μL 可包被 4 塊 6 孔板，分裝數(shù)量=5 mL/0.278=17.98。

2. 準(zhǔn)備 18 個(gè)無菌 1.5 mL EP 管，標(biāo)記 Matrigel 日期、操作人；1mL 無菌吸頭；EP 管架，均置于-20℃冰箱中預(yù)冷 1 小時(shí)。

3. 將 Matrigel 放置 4℃冰箱過夜解凍，當(dāng) Matrigel 完全解凍即可開始分裝。

注：在解凍時(shí)，將 Matrigel 放置冰箱內(nèi)側(cè)角落，切勿放在靠近冰箱門附近。

4. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預(yù)冷的 1.5 mL EP 管及 EP 管架、1mL吸頭放置于生物安全柜上。

5. 混勻 Matrigel，無菌分裝于各個(gè) 1.5 mL EP 管中，并置于冰上。當(dāng)吸頭被堵塞可能導(dǎo)致分裝體積不準(zhǔn)時(shí)需要更換吸頭。

6. 將分裝后的 Matrigel 置于-20℃冰箱中保存。

B. 鋪板

1. 取 36 mL 冷藏 DMEM/F12 于 50 mL 離心管中，準(zhǔn)備 4 個(gè) 6 孔板，標(biāo)記 Matrigel、批號、日期和操作人。

2.1 mL 無菌吸頭置于-20℃冰箱中預(yù)冷 1 小時(shí)，取出一支冷凍的 Matrigel（5mL）置于 4℃冰箱解凍至完全化凍。

3. 準(zhǔn)備一個(gè)裝滿碎冰的冰盒，將解凍過的 Matrigel、預(yù)冷的 1mL 吸頭放置于生物安全柜上。

4. 用預(yù)冷的吸頭向解凍過的 Matrigel（5mL），加入 1 mL 冷的 DMEM/F12 反復(fù)吹打解凍并混勻。

5. 吸出已解凍混勻的 Matrigel 加入離心管中剩余的 DMEM/F12，使用 10 mL 移液管再次反復(fù)吹打混勻。

6. 分裝 1.5 mL/孔于 4 個(gè)六孔板中，輕輕搖晃混勻。

7. 培養(yǎng)板置于室溫 1 小時(shí)后即可使用，或置于 4℃冷藏過夜，兩周內(nèi)使用。

五 、 復(fù)蘇 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）

1. 將水浴鍋預(yù)熱至 37℃。將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時(shí)恢復(fù)至室溫（15~30℃）。

2. 取 2 mL hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，加入 4uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為 10uM，取 9mL DMEM/F12，加入 18uL hESC/iPSC Supplement C 使終濃度為 10uM，恢復(fù)至室溫。。

注意：不要在 37℃水浴鍋中預(yù)溫培養(yǎng)基。

3. 取出 1 支冷凍的細(xì)胞置于 37℃水浴鍋手持輕輕搖晃，2 min 內(nèi)解凍，肉眼觀察細(xì)胞懸液內(nèi)冰晶即將完全消失時(shí)取出。

4. 75%酒精無塵紙擦拭凍存管表面，轉(zhuǎn)入生物安全柜；將細(xì)胞懸液移到事先準(zhǔn)備好的 15 mL離心管中，隨后逐滴加入 9mL DMEM/F12，過程中輕柔晃動混勻細(xì)胞，160 g 離心 5 min。

5. 吸除 6 孔板中 1 孔的 Matrigel 包被液，加入 2mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基。 

6. 離心完吸棄上清，至留下 50uL 左右的上清，輕彈管底 3-4 下至細(xì)胞混勻在上清中， 逐滴緩慢加入 1mL 含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，輕彈管底 3-4 下 混勻細(xì)胞，將這 1mL 細(xì)胞懸空滴加進(jìn) 6 孔板的含有 hESC/iPSC Supplement C 的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基中。 

7. 水平十字搖勻三次，置于 37℃，5% CO2濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字 搖勻三次培養(yǎng)。 

注：水平十字搖勻 3 次，左右兩次+上下兩次算一次。 

8. 18-24 小時(shí)后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，之后每天更換培養(yǎng)基。

表 4： hESC/iPSC 傳代&培養(yǎng)操作試劑推薦用量

六 、傳代 hESC/iPSC （以 6 孔板為例）

圖 1.hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基連續(xù)培養(yǎng) hESC 細(xì)胞形態(tài)圖：（A）和（C）分別 為 hESC 細(xì)胞培養(yǎng)第 2 和 4 天時(shí)低倍鏡 hESC 培養(yǎng)形態(tài)圖示，（B）和（D ）為培養(yǎng)至第 2 和 4 天時(shí)的高倍鏡hESC 培養(yǎng)形態(tài)圖。

1. 傳代條件：① 細(xì)胞匯合度達(dá) 85%左右（如圖 1(C-D)所示），一般情況下每 3-4 天傳代；

② 細(xì)胞匯合度較低，生長密度分布不均勻。

注：即使克隆團(tuán)較小、匯合度不足，也建議不要連續(xù)培養(yǎng)超過 5 天。

2. 傳代比例：可根據(jù)細(xì)胞生長狀態(tài)和實(shí)驗(yàn)需要按 1:5~1:12 的比例進(jìn)行傳代，如果細(xì)胞正常，克隆團(tuán)匯合度 85%，大小均勻（如圖 1(C-D)所示），建議按照 1:8 進(jìn)行傳代，如果密度偏低，則可降低傳代比例；密度偏高，則增加傳代比例。

注：1:8 傳代就是 1 個(gè)孔瓶傳 8 個(gè)孔（以 6 孔板為例）。

3. 將 Matrigel 包被的 6 孔板，提前放置生物安全柜中約 1 小時(shí)恢復(fù)至室溫（~25℃）。

4. 根據(jù)傳代接種的孔數(shù)準(zhǔn)備 2 mL/孔的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，加入hESC/iPSC Supplement C 終濃度為 10uM，恢復(fù)至室溫（~25℃）。

5. 將細(xì)胞六孔板孔內(nèi)培養(yǎng)基吸棄，加入 1 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃后吸棄。

6. 加入 1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution 使溶液完全覆蓋孔底。 

7. 置于 37℃培養(yǎng)箱中孵育 5-7 min。 

注：① 消化 5-6 min 后鏡下觀察細(xì)胞變化，當(dāng)大部分細(xì)胞變亮變圓，且細(xì)胞尚未脫離基 質(zhì)，若大部分細(xì)胞仍未變亮，則需要延長消化時(shí)間，不超過 8min； 

② 保持 6 孔板與培養(yǎng)箱金屬隔板直接接觸，使 6 孔板受熱均勻，不要疊放。

圖2 ：消化 hESC 細(xì)胞不同時(shí)間形態(tài)圖：（A）消化 6 min 低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的的形態(tài)圖;（B）消化 7 min低倍鏡 hESC 培養(yǎng)的的形態(tài)圖。

8.消化時(shí)吸取 6 孔板中的 Matrigel 溶液，加入預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC  Supplement C 2 mL/孔。 

9.消化結(jié)束后輕輕地將細(xì)胞培養(yǎng)板拿回生物安全柜，避免震蕩搖晃細(xì)胞，傾斜并吸除 hESC/iPSC Passage Solution。及時(shí)加入 1 mL/孔預(yù)溫的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基+ hESC/iPSC  Supplement C，將細(xì)胞吹下來。 

注：① 加 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基 + hESC/iPSC Supplement C 時(shí)，可輕柔吹打細(xì)胞不能 超過 2 次，避免反復(fù)吹打；有部分細(xì)胞（10%～15%）未脫離基質(zhì)是正常現(xiàn)象，若有大量細(xì) 胞未脫離則需延長消化時(shí)間（< 8min）。 

10.把這一毫升細(xì)胞懸液懸空滴加入板里的培養(yǎng)基，每孔 3-5 滴。在 6 孔板上標(biāo)記細(xì)胞名 稱、代次、傳代比例、日期、操作人，水平十字搖勻 3 次。 

注：可將傳完代后的細(xì)胞在鏡下觀察細(xì)胞密度，根據(jù)密度調(diào)整是否需要多加細(xì)胞滴。 

11.置于 37℃，5% CO2 濃度，飽和濕度的培養(yǎng)箱中，再次水平十字搖勻 3 次，不要疊 放。

12. 18-24 小時(shí)后換新的 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基，此后每天換液，第 4 天繼續(xù)傳代/凍存。

注：傳代后隔天算第 1 天。

七、凍存 hESC/iPSC

1. 當(dāng)細(xì)胞匯合度達(dá) 85%左右（如圖 1(C-D)所示）可收獲凍存，一般 6 孔板每孔可凍存 1 管。

2. 準(zhǔn)備相應(yīng)數(shù)量的 1.5/2 mL 凍存管，標(biāo)記細(xì)胞名稱、代次（P#）、日期、操作人。

3. 取出 4℃冰箱中的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，置于室溫預(yù)溫，使用前注意搖勻。

4. 吸取上清液，加入 2 mL/孔的 DPBS（不含鈣鎂），輕輕搖晃數(shù)次，再吸取。

5. 加入1 mL/孔的 hESC/iPSC Passage Solution，將細(xì)胞置于 37℃培養(yǎng)箱中，計(jì)時(shí) 8-9 min（可參考“ 六、傳代 hESC/iPSC”步驟）。

6. 消化結(jié)束，輕輕取出培養(yǎng)板，吸取 hESC/iPSC Passage Solution。

7. 搖勻預(yù)溫的 hESC/iPSC Cryopreservation Solution，每孔加入 1 mL 凍存液，輕柔吹打，水平十字搖勻 3 次，隨后吸取細(xì)胞懸液加入 1.5/2 mL 凍存管中。

8. 將細(xì)胞置于梯度程序降溫盒中，并置-80℃冰箱中過夜，次日轉(zhuǎn)入液氮罐中長期保存。

八、其他培養(yǎng)體系中 hESC/iPSC 更換為 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基條件的適應(yīng)

其他無飼養(yǎng)層條件培養(yǎng)的 hESC/iPSC 可以在細(xì)胞狀態(tài)良好時(shí)，使用原培養(yǎng)基進(jìn)行細(xì)胞傳代，24 小時(shí)后更換成混合培養(yǎng)基（原培養(yǎng)基與 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基按照 1:1 混合）培養(yǎng)，培養(yǎng) 2 代后完全換成 hESC/iPSC 完全培養(yǎng)基培養(yǎng)，培養(yǎng) 2-3 代后可完全適應(yīng)新的培養(yǎng)體系，此時(shí)可進(jìn)行細(xì)胞凍存處理。