口蹄疫病毒/塞內卡病毒檢測試劑盒（雙色實時熒光 PCR 法）說明書
【產品名稱】
通用名稱：口蹄疫病毒/塞內卡病毒檢測試劑盒（雙色實時熒光 PCR 法）
英文名稱：Foot and Mouth Disease Virus、Seneca virus A Detection Kit (Dual ChanelReal-Time PCR Method)
【包裝規(guī)格】 25T/盒 & 50T/盒
【預期用途】
本試劑盒適用于口蹄疫病毒/塞內卡病毒檢測，可用于臨床口蹄疫病毒/塞內卡病毒感染的輔助診斷，但不作確診使用。
【檢驗原理】
本試劑盒針對口蹄疫病毒/塞內卡病毒的高度保守區(qū)域設計特異性引物和探針，在反應體系中含口蹄疫病毒/塞內卡病毒基因組模板的情況下，PCR 反應得以進行并釋放熒光信號。利用熒光定量 PCR 儀對PCR 過程中相應通道信號進行實時監(jiān)測和輸出，實現檢測結果的定性分析。
【主要組成成份】
| 序號 | 組成 | 25T/盒 | 50T/盒 |
| 1 | SVA/FMDV RT-PCR 反應液 | 437.5 μL×1 管 | 875 μL×1 管 |
| 2 | SVA/FMDV 混合酶 | 62.5 μL×1 管 | 125 μL×1 管 |
| 3 | SVA/FMDV 陽性對照 | 40 μL×1 管 | 40 μL×1 管 |
| 4 | SVA/FMDV 陰性對照 | 40 μL×1 管 | 40 μL×1 管 |
| 5 | 說明書 | 1 份 | 1 份 |
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注：陰性對照為豬基因組 DNA，陽性對照為失去活性的口蹄疫病毒/塞內卡病毒cDNA。
【儲存條件及有效期】避光-20℃以下保存，避免反復凍融，有效期 12 個月。
【適用儀器】ABI 系列、Bio-Rad 系列、Agilent Stratagene MX 系列 、Roche LightCycler R480、Cepheid SmartCycler、Rotor-Gene 系列、杭州博日系列等多通道實時熒光定量PCR 儀。
【樣本要求】
1. 血液或血清樣品：使用無菌注射液抽取樣品置于離心管中待檢。
2. 肌肉或內臟樣品：取少量樣品（2～3 克）于研缽或勻漿器中研磨，然后將研磨勻漿轉入無菌離心管中，3000rpm/min離心 10 分鐘取上清待檢。
3. 應避免標本間交叉污染。
4. 標本收集后可立即檢測；若不能立即檢測，可置于 2～8℃冷藏過夜保存；如需長期保存，標本應凍存于-80℃以下，避免反復凍融。
【檢驗方法】
1. 試劑準備（試劑準備區(qū)）
（1） 從冰箱中取出試劑盒, 從試劑盒中取出實驗所需試劑,充分融化混勻并瞬時離心以去除管壁附著液體。
（2） 核算當次實驗所需要的反應數（n），并根據如下表所示反應體系計算當次實驗所需要的各種試劑量。
n =陰性對照數（1T）+陽性對照數（1T）+誤差預留量（1T）+樣本數
| 單反液配制表(每份) | RT-PCR 反應液 | 17.5 μL |
| 混合酶 | 2.5 μL |
（3） 在無菌離心管中加入上述試劑，充分混勻后瞬時離心。按照 20 μL/管分裝量將試劑分裝至PCR 反應管。
2. 樣本準備（樣本處理區(qū)）
用 QIAGEN、Roche 公司 RNA 提取試劑盒提取 RNA，具體操作按照其試劑盒說明書操作。
3. 加樣
在上述制備好的 PCR 反應樣本管中分別加入處理好的待測標本 RNA 各 5 μl、終體積 25 μl/管，蓋好 PCR 反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到PCR 儀器上。陰性對照和陽性對照管則各加 5 μL 試劑盒自帶的陰性對照或陽性對照品，終體積為 25 μl/管，蓋好 PCR 反應蓋混勻后瞬時低速離心，轉移到 PCR 儀器上。
4. PCR（PCR 擴增區(qū)）
（1） 取樣本處理區(qū)準備好的 PCR 反應管，放置在實時熒光定量 PCR 儀樣品槽相應位置，并記錄放置順序。
（2） 按下表設置儀器核酸擴增相關參數進行 PCR 擴增。
| 反應體積 | 25 μL | 通道選擇 | ROX 通道采集口蹄疫病毒熒光信號 FAM 通道采集塞內卡病毒熒光信號 |
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PCR 反應條件 | 步驟 | 條件 | 循環(huán)數 |
| 反轉錄 | 50℃：10 分鐘（min） | 1 | |
| 預變性 | 95℃：3 分鐘（min） | 1 | |
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PCR 擴增 | 95℃：5 秒（s） |
40 | |
| 55℃：40 秒（s） （此階段結束時采集熒光信號） |
注：ABI 系列熒光 PCR 儀在設置時不選 ROX 校正，設置淬滅基團選擇 None。
【參考值（參考范圍）】
1. 試劑盒有效性判定：
（1） 陽性對照：有典型 S 型擴增曲線或 Ct 值≤35。
（2） 陰性對照：Ct 值＞38 或無 Ct 值，線形為直線或輕微斜線，無指數增長期。
2. 標本結果判定：
（1） 陽性：標本檢測結果 Ct 值≤35 或有明顯指數增長期。
（2） 可疑：標本檢測結果 Ct 值在 35～38 范圍內。此時應對標本進行重復檢測，如重復實驗結果 Ct 值仍在35～ 38 范圍內，有明顯指數增長期，則判定為陽性，否則為陰性。
（3） 陰性：標本檢測結果 Ct 值＞38 或無 Ct 值。
【檢驗結果的解釋】
| 通道及檢測結果 | 標本檢測結果解釋 | |
| ROX | FAM | |
| + | + | 標本中檢出口蹄疫病毒/塞內卡病毒 RNA |
| + | - | 標本中檢出口蹄疫病毒 RNA，未檢出塞內卡病毒 RNA |
| - | + | 標本中檢出塞內卡病毒 RNA，未檢出口蹄疫病毒 RNA |
| - | - | 標本中未檢出口蹄疫病毒/塞內卡病毒 RNA |
【檢驗方法的局限性】
1. 當檢測樣本中被檢核酸濃度低于本試劑盒的最低檢出限時可能會發(fā)生假陰性的結果。
2. 被檢樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中操作方式不當容易造成 RNA 降解而產生假陰性結果。
3. 樣本在采集、運輸、儲存以及處理過程中發(fā)生交叉污染，則容易得到假陽性結果。
【產品性能指標】 產品的最低檢出限為 103 Copies/mL，產品 CV 值≤3%。
【注意事項】
1. 使用本試劑盒的實驗室，應嚴格按照國家有關部分頒布的有關基因擴增檢驗實驗室管理規(guī)范進行管理；
2. 為避免 RNA 降解，樣本處理過程應在 0-4℃條件下操作，且完成實驗后立即上機檢測；樣本處理過程中使用的器具耗材應經過無核酶處理；
3. 各區(qū)域物品均為專用，不得交叉使用，以免污染；檢測結束后，應立即對工作臺清潔；
4. 吸取反應液時，應盡量避免產生氣泡；上 PCR 儀前，應注意檢查各反應管是否蓋緊，以免液體蒸發(fā)造成結果不準確；
5. 試劑盒所有試劑在使用前應該在常溫下充分融化混勻，并應瞬時離心；
6. 試劑盒內所配陰性和陽性對照在第一次使用前應全部轉移至標本準備區(qū)，并單獨存放；
7. 為防止熒光干擾，應避免裸手直接接觸 PCR 反應管，并應避免在 PCR 反應管上進行任何標記；
8. 檢測過程中使用過的吸頭，應直接打到盛有 10%次氯酸的廢物缸內，檢測結束的 PCR 反應管，切忌開蓋，并與其他廢棄物品一同滅菌后丟棄；工作臺及各種實驗用品應定期用 10%次氯酸、75%酒精或紫外燈進行消毒；
9. 儀器擴增相關參數應按照本說明書相關要求進行設置；不同批號試劑不能混用；并在有效期內使用。
