| Multiplex PCR又稱多重PCR，是指在同一PCR反應(yīng)體系里加上兩對(duì)以上引物，同時(shí)擴(kuò)增出多個(gè)核酸片段的PCR反應(yīng)，已被廣泛應(yīng)用于科學(xué)研究和疾病診斷等多個(gè)領(lǐng)域，特別適用于微量樣本的多位點(diǎn)檢測(cè)。 RAPA3G Multiplex PCR Mix（多重PCR Mix）使用具有超強(qiáng)擴(kuò)增性能的熱啟動(dòng)RAPA3G DNA聚合酶和優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)緩沖液，使其可有效擴(kuò)增20重以上的PCR，具有極高的靈敏度，最大程度上減少了反應(yīng)體系優(yōu)化步驟。 | ||
特征 | ||
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儲(chǔ)存 | ||
| 長(zhǎng)期儲(chǔ)存置于-20°C以下，可保存2年，避免反復(fù)凍融；短期使用置于4°C（3個(gè)月）保存，一經(jīng)融化后請(qǐng)放置于4°C，勿再凍存。 | ||
反應(yīng)實(shí)例 | ||
| 1. 應(yīng)用2xRAPA3G Multiplex PCR Mix進(jìn)行20重PCR擴(kuò)增；用0.1ng、1ng、10ng和100ng的人基因組分別擴(kuò)增30和35個(gè)循環(huán)，4%的瓊脂糖凝膠，80V電泳300min，如圖所示該Multiplex PCR Mix對(duì)不同量的模板具有很好的兼容性，且靈敏度可至0.1ng。 | ||
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| 2.應(yīng)用2xRAPA3G Multiplex PCR Mix分別用不同的模板進(jìn)行20重PCR擴(kuò)增，泳道1-5分別為：1μl抗凝全血分離的白細(xì)胞（相當(dāng)于5μl抗凝全血）、1μl抗凝全血、1μl血清、1μl含50ng human gDNA的血清和50ng human gDNA， 結(jié)果顯示RAPA3G Multiplex PCR Mix具有較強(qiáng)的抗雜質(zhì)能力，對(duì)于全血等樣品也能較好的擴(kuò)增。 | ||
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| 3.應(yīng)用2xRAPA3G Multiplex PCR Mix和Supplier A和 Supplier B的同類產(chǎn)品進(jìn)行15重PCR擴(kuò)增，比較如下圖，可見(jiàn)RAPA3G Multiplex PCR Mix擴(kuò)增性能較其他同類產(chǎn)品具有卓越的擴(kuò)增性能。 | ||
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注意事項(xiàng) | ||
| 1.當(dāng)模板GC含量>70%時(shí)，請(qǐng)?zhí)砑?×Q-Solution（Cat. No.: A3002）。 2.推薦引物設(shè)計(jì)原則：引物長(zhǎng)度保持在22 - 30 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度在2kb以下，GC含量50% - 60%，盡量減少各引物之間TM的差值。 3.檢測(cè)單引物特異性：多重PCR反應(yīng)前，應(yīng)對(duì)設(shè)計(jì)的引物逐一擴(kuò)增，以確定是否有非特異性擴(kuò)增和擴(kuò)增效率。 4.引物推薦使用濃度：推薦擴(kuò)增片段<300bp每條引物的反應(yīng)終濃度為0.2-0.3μM，擴(kuò)增片段>300bp每條引物的反應(yīng)終濃度為0.05-0.15μM，如某些目標(biāo)片段產(chǎn)量偏低或偏高，可適度調(diào)整其對(duì)應(yīng)引物使用量以優(yōu)化反應(yīng)結(jié)果。 5.反應(yīng)前需將引物制成10×Primer Mix：預(yù)先混合所有擴(kuò)增引物，使每條引物濃度為0.5 ~3 μM。 | ||
常見(jiàn)問(wèn)題及解決方案 | ||
| 1. 擴(kuò)增產(chǎn)物少或沒(méi)有擴(kuò)增。 (1) 降低退火溫度（每個(gè)梯度降低1℃）。 (2) 增加模板量 (3) 增加PCR循環(huán)數(shù)。 (4) 增加退火時(shí)間為90 sec，必要時(shí)可延長(zhǎng)退火時(shí)間至3 min。 (5) 增加引物使用量。 2. 存在非特異性擴(kuò)增。 (1) 減少循環(huán)數(shù)，提高退火溫度（每個(gè)梯度降低1℃）。 (2) 減少引物使用量。 (3) 重新設(shè)計(jì)引物。 3. 電泳時(shí)條帶模糊。 (1) 減少循環(huán)數(shù)(每次減少3個(gè)循環(huán))。 (2) 減少起始模板量。 (3) 延長(zhǎng)徹底延伸步驟時(shí)間至15 - 30 min。 (4) 減少退火時(shí)間。 |
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